Méthodologie pour l'obtention de structures par cryo-EM de complexes anticorps-antigènes appliquée aux deux protéines sHER2 et NS4

Methodology for obtaining cryo-EM structures of antibody-antigen complexes applied to the two protein sHER2 and NS4

• Auteur / Autrice : Rémi Ruedas
• Direction : Stéphane Bressanelli, Magali Mathieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 20/11/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Nessler
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Valérie Biou, Pierre-Damien Coureux, Aurélie Bertin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Valérie Biou, Pierre-Damien Coureux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Norovirus

Récepteurs du facteur de croissance épidermique

Biophysique

Interactions protéine-protéine

Anticorps monoclonaux

Trastuzumab

Microscopie électronique en transmission

Mots clés libres

Cryo-EM

Trastuzumab

Pertuzumab

Anticorps

Alpharep

Biophysique

Cryo-EM

Trastuzumab

Pertuzumab

Antibodies

Alphareps

Biophysics

Résumé

L'analyse en particules uniques (SPA) par microscopie électronique à transmission cryogénique (Cryo-EM) permet aujourd'hui l'analyse structurale à l'état natif d'une large gamme de protéines et de complexes macromoléculaires. Elle est particulièrement intéressante pour les complexes pour lesquels la prédiction de la structure reste difficile, tels que les complexes anticorps-antigènes. Nous couvrons dans ce manuscrit plusieurs points de validation aux étapes pré-microscope, in-microscope et post-microscope. Nous détaillons une large gamme d'analyses biophysiques permettant une description détaillée des propriétés biochimiques des échantillons en solution. À la suite de ces analyses, nous discutons de l'approche optimale de préparation et criblage de grilles de Cryo-EM. La dernière partie est consacrée au traitement des données avec des analyses exhaustives de l'effet du matériau de la grille sur l'échantillon. Nous exposons une application pratique des logiciels actuels pour faire face à l'hétérogénéité conformationnelle continue. Ces travaux ont permis l'obtention de la première carte expérimentale au-delà de 3 Angströms de résolution du complexe ternaire flexible "HTP" de 162 kDa entre le récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) et les fragments de liaison à l'antigène (Fab) de deux anticorps thérapeutiques distincts, le pertuzumab et le trastuzumab. Notre carte mieux définie que les précédentes, à permis de mettre en lumière une interaction précédemment négligée qui pourrait expliquer l'effet synergique des anticorps. Le troisième chapitre reprend l'approche développé avec le complexe HTP en l'appliquant à la protéine non structurale de norovirus NS4. Cette partie apporte les premiers résultats exhaustifs des propriétés biochimique de la protéine NS4. Elle expose également les limitations de l'utilisation des anticorps monoclonaux comme outils d'analyse structurale. Enfin il est montré comment nous avons réussi à obtenir un catalogue diversifié de protéines artificielles "alpharep" ciblant NS4 ainsi que les premières applications possibles.

Single particle analysis (SPA) from cryogenic transmission electron microscopy (Cryo-EM) nowadays allows structural analysis in the native state of a broad range of proteins and macromolecular complexes. It is particularly attractive for complexes for which structure prediction remains intractable, such as antibody-antigen complexes. In the second chapter of this manuscript, we cover several validation points at the pre-microscope, in-microscope and post-microscope stages for the studies of such complexes by cryo-EM. We detail a wide range of biophysical analyses allowing a detailed description of the biochemical properties of samples in solution. Following these analyses, we discuss the optimal approach for preparing and screening Cryo-EM grids. The last part is devoted to data processing, with exhaustive analyses of the effect of the grid material on the sample. We also present a practical application of current software to deal with continuous conformational heterogeneity. This part shows how we manage to obtain the first experimental map bellow 3 Angstroms resolution of the flexible ternary complex "HTP" between the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and the antigen-binding fragments (Fab) of two distinct therapeutic antibodies, pertuzumab and trastuzumab. Our map, which is better defined than previous ones, has brought to light a previously neglected interaction that could explain the synergistic effect of the antibodies.The third chapter takes up the approach developed with the HTP complex by applying it to the non-structural norovirus protein NS4. This section provides the first comprehensive results on the biochemical properties of the NS4 protein. It also outlines the limitations of using monoclonal antibodies as structural analysis tools. Finally, it shows how we have succeeded in obtaining a diversified catalogue of artificial proteins "alpharep" targeting NS4, as well as the first possible applications.