Caractérisation de toxines animales innovantes pour l'étude fonctionnelle des récepteurs aux angiotensines

Characterization of innovative animal toxins for the functional study of angiotensin receptors

• Auteur / Autrice : Anne-Cécile Van Baelen
• Direction : Philippe Robin, Nicolas Gilles
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences pharmacologiques
• Date : Soutenance le 14/03/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et technologies pour la santé (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Véronique Leblais
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sébastien Dutertre, Séverine Morisset-Lopez, Bernard Mouillac, Christian Legros
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sébastien Dutertre, Séverine Morisset-Lopez

Mots clés

Mots clés contrôlés

Angiotensine

Angiotensine II

Système rénine-angiotensine

Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Hypertension artérielle

Venin

Toxines

Mots clés libres

Récepteur à l'angiotensine II

Hypertension artérielle

Bret/fret

Toxines animales

Venins

Chimie peptidique

Angiotensin II receptor

Arterial hypertension

Bret/fret

Animal toxin

Venoms

Peptidic chemistry

Résumé

Au niveau physiopathologique, le système rénine-angiotensine (SRA) est un des systèmes responsables de la régulation de la fonction cardiovasculaire. Le principal médiateur du SRA est l'angiotensine II (AngII) ayant pour cible le récepteur à l'angiotensine de type 1 (AT1), qui, une fois activé, est responsable entre autres d'une augmentation de la pression artérielle. Il existe d'autres effecteurs du SRA qui auraient des effets opposés à ceux de l'axe AngII/AT1. C'est le cas notamment des peptides angiotensine 1-7 ou alamandine qui cibleraient respectivement les récepteurs Mas et MrgD, ou encore du récepteur AT2, qui une fois activé par AngII entraine des effets cardiobénéfiques. Ces récepteurs aux angiotensines sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), aux voies de signalisation intracellulaires multiples qui sont encore peu étudiés et dont les rôles biologiques ne sont pas parfaitement élucidés. L'idée est donc de mieux comprendre quels sont les mécanismes de transduction du signal impliquant ces récepteurs aux angiotensines par la découverte de nouveaux outils permettant leur étude fonctionnelle. Pour permettre l'étude de ces récepteurs, nous devons trouver des ligands innovants qui se lient au récepteur, de façon spécifique et sélective. Il existe une source de ligands prometteurs encore sous-étudiée qui répondrait à ces critères : les toxines issues de venins d'animaux. Ces venins constituent une vaste bibliothèque de toxines peptidiques aux propriétés pharmacologiques particulières, avec une affinité et une sélectivité élevées pour leurs cibles chez leurs proies. Il existe peu de toxines ciblant les RCPG, et à ce jour, aucune n'est identifiée comme ciblant les récepteurs aux angiotensines.Nous avons donc criblé une banque de 900 toxines synthétiques sur le récepteur AT2. 3 toxines ont été mises en évidence avec des affinités de l'ordre du µM. Ces toxines ont été produites par synthèse peptidique sur phase solide et ont subi une étape d'oxydation pour former les ponts disulfure nécessaires à l'obtention de la forme finale fonctionnelle de la toxine. Ces toxines ont ensuite été caractérisées par des études de liaison sur les récepteurs AT2 puis AT1. Une toxine, A-CTX-cMila, présente une affinité 100 fois plus intéressante pour AT1 que pour AT2 (Ki de 300 nM). C'est une toxine cyclique de 7 résidus issue de Conus miliaris. La caractérisation pharmacologique s'est concentrée sur cette toxine et sur le récepteur AT1. Par des méthodes de dosages de seconds messagers par FRET et par utilisation de biosenseurs de BRET, nous avons montré que la toxine est un antagoniste compétitif du récepteur AT1. Elle bloque les voies Gq, Gi, Go, ainsi que le recrutement de la β-arrestine et l'activation de ERK1/2.

At the pathophysiological level, the renin-angiotensin system (RAS) is one of the systems responsible for the regulation of cardiovascular function. The main mediator of the RAS is angiotensin II (AngII), which targets the angiotensin type 1 (AT1) receptor, which, when activated, is responsible for, among other things, an increase in blood pressure. There are other effectors of the RAS that are thought to have opposite effects to those of the AngII/AT1 axis. This is the case in particular for the angiotensin 1-7 or alamandine peptides which target the Mas and MrgD receptors respectively, or the AT2 receptor, which once activated by AngII leads to cardiobeneficial effects. These angiotensin receptors are G protein-coupled receptors (GPCRs) with multiple intracellular signalling pathways that are still poorly studied and whose biological roles are not fully understood. The idea is therefore to better understand the signal transduction mechanisms involving these angiotensin receptors through the discovery of new tools allowing their functional study. To enable the study of these receptors, we need to find novel ligands that bind to the receptor in a specific and selective manner. One promising and understudied source of ligands that would meet these criteria is toxins from animal venoms. These venoms constitute a vast library of peptidic toxins with specific pharmacological properties, high affinity and selectivity for their targets in their prey. There are few toxins targeting GPCRs, and to date none identified as targeting angiotensin receptors.We therefore screened a library of 900 synthetic toxins on the AT2 receptor. 3 toxins were identified with affinities in the µM range. These toxins were produced by solid phase peptide synthesis and underwent an oxidation step to form the disulphide bridges necessary to obtain the final functional form of the toxin. These toxins were then characterised by binding studies on AT2 and then AT1 receptors. One toxin, A-CTX-cMila, has a 100-fold higher affinity for AT1 than for AT2 (Ki of 300 nM). It is a cyclic toxin of 7 residues from Conus miliaris. Pharmacological characterisation focused on this toxin and on AT1 receptor. Using FRET second messenger assays and BRET biosensors, we showed that the toxin is a competitive antagonist of the AT1 receptor. It blocks the Gq, Gi, Go pathways, as well as β-arrestin recruitment and ERK1/2 activation.