Optimization of exon skipping therapy for the treatment of Duchenne muscular dystrophy
Optimisation de la stratégie de saut d'exon pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne
Résumé
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked recessive disorder that affects 20 out of 100,000 boys. It is characterized by progressive muscle weakness leading to loss of ambulation between the ages of 8 and 14 years and a decreased life expectancy (mean age of death: 35 years). DMD is caused by mutations in the DMD gene that lead to an absence of the dystrophin protein. There are currently no curative treatment options available. Nevertheless, promising therapy is under development and is based on the exon skipping strategy. Antisense oligonucleotides are used to modulate the splicing of pre-messenger RNA, restore the RNA open reading frame and thus produce functional dystrophin. This strategy has already led to the approval of 4 drugs in the United States but, due to their low efficacy, none of them have been accepted in Europe. These various molecules led only to very low levels of dystrophin restoration (from 1 to 6%), which are not enough to expect a significant therapeutic benefit in patientsMy thesis project therefore aims to optimize the efficacy of the exon-skipping approach by developing combined strategies. To this end, the tricyclo-DNA antisense oligonucleotides developed in my laboratory were co-administered with different molecules.The first therapeutic combination we tested aimed at reducing the urinary elimination of oligonucleotides in order to improve their bioavailability. It has previously been demonstrated that a large proportion of oligonucleotides are eliminated in the urine. A histological study performed in kidney of treated mice revealed a colocalization between the tricyclo-DNA oligonucleotides and the OAT transporters present in the proximal convoluted tubules of the kidney. Unfortunately, their inhibition with Probenecid (a pan OAT transporter inhibitor) did not improve the efficacy of our antisense treatment.The second therapeutic combination we tested aimed at improving the intracellular transport of the oligonucleotides. Oligonucleotides enter in cells by endocytosis. To perform exon skipping, they must leave the endosomes and go into the cell nucleus where the pre-messenger RNA is located. Unfortunately, only a tiny part of them succeeds, while the majority is eliminated by the cell. To help oligonucleotides to exit endosomes, a molecule called UNC7938 was used. This molecule creates pores in the late endosomes membrane which allows the oligonucleotides to come out. Combination of the two treatments increased restoration of dystrophin levels by 31% in the heart and 58% in the diaphragm. In addition, cardiac function was normalized after 12 weeks of treatment.The last therapeutic combination we tested aimed to increase the quantity of pre-messenger RNA produced in order to increase the potential number of targets for our treatment. Three histone deacetylase inhibitors (HDACi) were tested: givinostat (a pan HDACi already used in a clinical trial in DMD), valproic acid (a class I/II HDAC inhibitor) and EX527 (a class III inhibitor). After 4 weeks of co-treatment with the oligonucleotide, valproic acid and givinostat improved the effectiveness of oligonucleotides by increasing dystrophin production by up to +74%. Additionally, co-treatment with valproic acid for 12 weeks significantly improved the muscle function of the animals.In summary, our results establish the proof of principle that combining small molecules to antisense oligonucleotides can improve the efficiency of exon skipping.
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie récessive liée à l'X qui touche 20 garçons sur 100 000. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire progressive conduisant à une perte de la marche entre 8 et 14 ans puis par le décès des patients autour de 35 ans. La maladie est provoquée par des mutations dans le gène DMD qui conduisent à une absence de la protéine dystrophine. Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement capable de guérir tous les patients. Néanmoins, une stratégie très prometteuse est en développement et repose sur le principe du saut d'exon. Pour ce faire, des oligonucléotides antisens sont utilisés pour moduler l'épissage de l'ARN pré-messager, restaurer le cadre de lecture de l'ARN et ainsi produire une dystrophine fonctionnelle. Cette stratégie a déjà conduit à la mise sur le marché de 4 médicaments aux Etats-Unis mais, en raison de leur faible efficacité, aucun n'a été accepté en Europe. En effet, ces différentes molécules n'ont conduit qu'à des niveaux très faibles de restauration de la dystrophine (de 1 à 6%) ce qui est insuffisants pour espérer un bénéfice thérapeutique significatif chez les patients. Mon projet de thèse a donc pour objectif d'optimiser l'efficacité de l'approche de saut d'exon en développant des stratégies combinées. Pour ce faire, des oligonucléotides antisens de type tricyclo-DNA développés dans le laboratoire ont été co-administrés avec différentes molécules. La première combinaison thérapeutique que nous avons testé avait pour objectif de diminuer l'élimination urinaire des oligonucléotides afin d'améliorer leur biodisponibilité. En effet, la majorité des oligonucléotides sont éliminés dans les urines après une administration systémique. Nous avons réalisé une étude histologique et montré une colocalisation entre les oligonucléotides et les transporteurs OAT présents dans les tubes contournés proximaux du rein. Malheureusement, leur inhibition avec le probénécid (un inhibiteur des transporteurs OAT) n'a pas permis d'améliorer l'efficacité de notre traitement antisens. La seconde combinaison thérapeutique que nous avons testée avait pour objectif d'améliorer le transport intracellulaire des oligonucléotides. Les oligonucléotides entrent en effet dans les cellules par endocytose. Pour pouvoir être actif, ils doivent donc sortir des endosomes et aller dans le noyau cellulaire où se trouve l'ARN pré-messager. Malheureusement, seulement une infime partie d'entre eux y parvient, les autres sont éliminés par la cellule. Afin d'aider les oligonucléotides à sortir des endosomes, une molécule appelée UNC7938 fut utilisée. Cette molécule crée des pores dans les endosomes tardifs permettant ainsi aux oligonucléotides d'en sortir. La combinaison des deux traitements a permis d'augmenter les niveaux de dystrophine restaurée de 31% dans le cœur et de 58% dans le diaphragme. De plus, la fonction cardiaque fut normalisée après 12 semaines de traitement.La dernière combinaison thérapeutique que nous avons testée avait pour objectif d'augmenter les quantités d'ARN pré-messagers produits afin d'augmenter le nombre potentiel de cibles pour notre traitement. Trois inhibiteurs d'histone deacetylase (HDACi) ont été testés : le givinostat (a pan HDACi déjà utilisé en essai clinique dans DMD), l'acide valproique (un inhibiteur des HDAC de classe I/II) et EX527 (un inhibiteur des classe III). Apres 4 semaines de co-traitement avec notre oligonucléotide, l'acide valproique et le givinostat ont permis d'améliorer l'efficacité des oligonucléotides en augmentant jusqu'à +74% la production de dystrophine. De plus, un co-traitement de 12 semaines avec l'acide valproique a significativement amélioré la fonction musculaire des animaux. Tous ces résultats ont permis de démontrer la preuve de principe quant à l'utilisation de petites molécules pour améliorer l'efficacité du saut d'exon.
Origine : Version validée par le jury (STAR)