Ingénierie métabolique de cyanobactéries pour la production photosynthétique de terpènes

Cyanobacteria metabolic engineering for photosynthetic terpene production

• Auteur / Autrice : Marine Vincent
• Direction : Franck Chauvat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Benoît Alunni
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amel Latifi, Yonghua Li-Beisson, Pierre Crozet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Amel Latifi, Yonghua Li-Beisson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Photosynthèse

Sesquiterpènes

Monoterpènes

Terpènes

Biocarburants

Ingénierie métabolique

Biologie de synthèse

Cyanobactéries

Mots clés libres

Cyanobactéries

Biologie de synthèse

Biocarburants

Terpènes

Fixation CO2

Cyanobacteria

Synthetic biology

Biofuels

Terpenes

CO2 fixation

Résumé

Les cyanobactéries peuvent produire des composés d'intérêt industriel, à partir de l'énergie solaire, d'eau (même polluée) et de CO₂. Au laboratoire on s'intéresse aux terpènes car ils sont volatiles (faciles à récolter), dotés d'odeurs agréables (''intérêt cosmétique'') et d'une forte densité énergétique (''intérêt biocarburant'').Notre approche met à profit la diversité physiologique des cyanobactéries et la diversité chimique des terpènes dans l'objectif futur de générer des productions économiquement viables. Ainsi, j'ai travaillé avec deux cyanobactéries modèles différentes, Synechocystis PCC 6803 (S.6803) et Synechococcus PCC 7002 (S.7002), qui sont capables de croître dans des eaux salées (plus abondantes que l'eau douce). Nous avons construit des souches productrices de terpènes génétiquement stables. Nous avons montré, pour la première fois, que S.6803 peut produire du farnésène, et aussi du santalène (jamais produit par une cyanobactérie auparavant (Blanc-Garin et al., 2022), et que S.7002 peut produire du farnésène (Chenebault et al., 2023). Chez ces deux cyanobactéries, la production de terpènes augmente parallèlement à l'expression des gènes (ts) codant pour les terpènes synthases (Blanc-Garin et al., 2022 ; Chenebault et al., 2023). Les productions de terpènes chez S.6803 cultivée en nitrate (la source d'azote classique) ou en urée (moins coûteuse) sont équivalentes. Par contre chez S.7002, la production de terpènes est meilleure avec l'urée (Blanc-Garin et al., 2022 ; Chenebault et al., 2023).Comme S.6803 produit mieux le farnésène que les autres terpènes (et mieux que S.7002), et que S.7002 produit mieux le limonène que S.6803 (Chenebault et al., 2023), nous avons travaillé à améliorer ces producteurs. J'ai analysé l'influence de la fixation, distribution et/ou stockage de carbone sur la production de terpènes. La surexpression des gènes codant pour la RuBisCO et la phosphoribulokinase a augmenté la production du farnésène chez S.6803, mais pas du limonène chez S.7002 (manuscrit en préparation). Par contre, la production de farnésène chez S.6803 n'augmente pas lorsque l'on tente d'économiser le carbone, en interrompant la synthèse de polyhydroxybutyrates ou en interférant avec la synthèse des caroténoïdes. En partie conformément à notre attente, j'ai montré que la surexpression chez S.7002 du gène crtE de S.6803 (crtE₆₈₀₃), mais pas de crtE₇₀₀₂, augmente la production de farnésène (manuscrit en préparation). Par contre, chez S.6803 la surexpression de crtE₆₈₀₃ ou de crtE₇₀₀₂ n'augmente pas la production de farnésène ni de limonène. L'ensemble de ces résultats valide l'intérêt de prendre en compte la diversité biologique des cyanobactéries, et chimique des terpènes, pour générer, à terme, de bons producteurs.Pour éviter que les cyanobactéries génétiquement modifiées (OGM) s'échappent de leurs bioréacteurs, nous avons vérifié chez S.6803 que la délétion des gènes ccmK3 et ccmK4 impliquées dans l'assemblage du carboxysome, génère des souches incapables de pousser en condition de faible teneur en CO₂ qui règne dans les milieux naturels. Ces mutants ∆ccmK3-ccmK4 conservent la capacité à produire le limonène (production faible donc peu ''gourmande'' » en CO₂). Par contre, ils produisent le farnésène moins efficacement que la souche sauvage (manuscrit en préparation).Enfin, dans l'objectif à terme de produire des terpènes sans utiliser de nitrate ou d'urée, j'ai travaillé avec deux cyanobactéries capables d'utiliser le N₂ atmosphérique : Cyanothece PCC 7822 (C.7822) et Gloeothece PCC 6909 (G.6909). J'ai établi un protocole de conjugaison efficace pour G.6909 qui m'a permis d'introduire nos plasmides producteurs de terpènes (les productions sont faibles). Par contre, C.7822 s'est révélée réfractaire à la conjugaison.

Cyanobacteria can produce compounds of industrial interest, from solar energy, water (even polluted) and CO₂. In the laboratory we are interested in terpenes because they are volatile (easy to harvest), have good smells (''cosmetic interest'') and a high energy density (''biofuel interest'').Our approach takes advantage of the physiological diversity of cyanobacteria and the chemical diversity of terpenes with the future objective of generating economically viable production. Thus, I worked with two different model cyanobacteria, Synechocystis PCC 6803 (S.6803) and Synechococcus PCC 7002 (S.7002), which are capable of growing in salt water (more abundant than fresh water). We have constructed genetically stable terpene producing strains. We have shown, for the first time, that S.6803 can produce farnesene, and also santalene (never produced by a cyanobacterium before (Blanc-Garin et al., 2022), and that S.7002 can produce farnesene (Chenebault et al., 2023). In these two cyanobacteria, the production of terpenes increases in parallel with the expression of genes (ts) coding for terpene synthases (Blanc-Garin et al., 2022; Chenebault et al., 2023). The production of terpenes in S.6803 cultivated in nitrate (the classic nitrogen source) or in urea (less expensive) is equivalent. On the other hand, in S.7002, the production of terpenes is better with urea (Blanc-Garin et al., 2022; Chenebault et al., 2023).As S.6803 produces farnesene better than other terpenes (and better than S.7002), and S.7002 produces limonene better than S.6803 (Chenebault et al., 2023), we worked to improve these producers. I analyzed the influence of carbon fixation, distribution and/or storage on terpene production. Overexpression of the genes encoding RuBisCO and phosphoribulokinase increased the production of farnesene in S.6803, but not limonene in S.7002 (manuscript in preparation). On the other hand, farnesene production in S.6803 does not increase when trying to save carbon, by interrupting the synthesis of polyhydroxybutyrates or by interfering with the synthesis of carotenoids. Partly consistent with our expectation, I showed that overexpression in S.7002 of the crtE gene from S.6803 (crtE₆₈₀₃), but not crtE₇₀₀₂, increases farnesene production (manuscript in preparation). On the other hand, in S.6803, the overexpression of crtE₆₈₀₃ or crtE₇₀₀₂ does not increase the production of farnesene or limonene. All of these results validate the interest in taking into account the biological diversity of cyanobacteria, and the chemical diversity of terpenes, to generate good producers.To prevent genetically modified cyanobacteria (GMO) from escaping from their bioreactors, we verified in S.6803 that the deletion of the ccmK3 and ccmK4 genes involved in the assembly of the carboxysome, generates strains unable of growing in conditions of low CO₂ content which reigns in natural environments. These ∆ccmK3-ccmK4 mutants retain the capacity to produce limonene (low production and therefore not very ''greedy'' in CO₂). On the other hand, they produce farnesene less efficiently than the wild type strain (manuscript in preparation).Finally, with the ultimate goal of producing terpenes without using nitrate or urea, I worked with two cyanobacteria capable of using atmospheric N₂: Cyanothece PCC 7822 (C.7822) and Gloeothece PCC 6909 (G .6909). I established an efficient conjugation protocol for G.6909 which allowed me to introduce our terpene-producing plasmids (productions are low). On the other hand, C.7822 proved to be refractory to conjugation.