Étude de la méthylation des gènes STAT3, IL2RA et CDH1 dans la maladie de Crohn iléale

Methylation study of STAT3, IL2RA and CDH1 genes in ileal Crohn’s disease

• Auteur / Autrice : Solafah Abdalla
• Direction : Antoine Brouquet, Pierre-François Bougnères
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 07/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Maladies et hormones du système nerveux (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : François Amalric
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Amalric, Laura Beyer-Berjot, Diane Goere, Gianpaolo De Filippo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : François Amalric, Laura Beyer-Berjot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin

Maladie de Crohn

Méthylation

Épigénétique

Mots clés libres

Épigénétique

Méthylation

Maladie de Crohn

Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin

Epigenetics

Methylation

Crohn's disease

Inflammatory bowel diseases

Résumé

Introduction: La maladie de Crohn (MC) est caractérisée par une réponse immunitaire anormale au microbiote intestinal, associée à une perte de l’intégrité de la barrière intestinale chez des individus prédisposés. Deux gènes de la réponse immunitaire potentiellement soumis à une régulation épigénétique par méthylation de l’ADN et impliqués dans la pathogénie de la MC ont retenu notre attention. Le gène du facteur de transcription STAT3, exprimé dans les lymphocytes T CD4 naïfs (CD4N) et intervenant dans les voies de signalisation de l’inflammation chronique et la carcinogenèse colorectale. D’autre part le gène du récepteur IL2RA, exprimé dans les lymphocytes T régulateurs (Treg), dont le nombre et la fonction sont diminués dans la muqueuse inflammatoire de la MC. Nous nous sommes aussi intéressés au phénomène d’hyperperméabilité épithéliale, qui semble jouer un rôle clé dans la pathogénie de la MC. Le gène CDH1 code pour la protéine E-cadhérine assurant la cohésion de la barrière intestinale. Il semblerait qu’il y ait une perte d’expression de CDH1 dans la MC et que l’origine de cette perte d’expression pourrait être expliquée par la méthylation. L’objectif de cette thèse était de comparer la méthylation de plusieurs régions des gènes STAT3, IL2RA et CDH1 dans la MC iléale de patients MC et de contrôles. Méthode : Nous avons prélevé du sang périphérique et des échantillons de muqueuse iléale de patients nouvellement opérés d’une MC iléale (groupe MC) et de patients opérés pour une maladie non inflammatoire (groupe contrôle). Dans le sang, nous avons trié les CD4N et les Treg. L’ADN a été extrait et nous avons analysé la méthylation de plusieurs régions d’intérêt des gènes STAT3, IL2RA et CDH1. Pour STAT3, l’analyse de la méthylation des 4 CG du promoteur et des 2 CG de l’intron 1 a été effectuée par pyroséquençage. De même pour l’analyse des CG des 4 régions d’intérêt du promoteur de IL2RA et d’une région d’intérêt dans l’intron 1. Pour CDH1, la méthylation de l’ilôt CG du promoteur a été étudiée par MSP et celle des CG du 7e enhancer a été effectuée par pyroséquençage. Résultats : Etude STAT3 : 14 échantillons (6 MC, 9 contrôles). Il existait une hypométhylation significative des 4CG du promoteur dans la muqueuse iléale inflammatoire comparée à la muqueuse iléale normale (p=0.02). Il existait une méthylation différentielle tissu spécifique significative entre la méthylation des CD4N des PBMC et celle de la muqueuse digestive avec une hypométhylation de du CG1 (p=0.03) et du CG2 (p<0.01) de l’intron 1 (p=0.03). Etude IL2RA : 36 échantillons (17 MC et 19 contrôles). Il n’y avait pas de différence significative de méthylation des CG des 5 régions d’intérêt de IL2RA entre les MC et les contrôles. Dans la région PRR IVr, la méthylation des 4 CG était corrélée positivement. Dans la région PRR III, la méthylation des 4 CG (-3946, -3851, -3789, -3691) était corrélée positivement, à l’exception du CG -3970. Dans la région PRR I-II-NRE, parmi les 6 CG, seuls les CG - 456, -373, -356 avaient une méthylation corrélée positivement. Etude CDH1 : 37 échantillons (21 MC et 16 contrôles). Dans la muqueuse iléale, l’ilôt CG du promoteur de CDH1 était méthylé chez 90% des MC contre 50% des contrôles (p<0.01). Dans le PBMC, il n’y avait pas de différence significative (52% des MC vs 44% des contrôles). La méthylation des 4 CG de l’enhancer de CHD1 était plus haute chez les MC (45±17% chez MC vs 36±17% chez les contrôles, p<0.001), alors qu’elle était comparable dans les PBMC. Conclusion :Il existe une association significative entre la méthylation de STAT3 et de CDH1 et la MC iléale. Pour STAT3, cette méthylation pourrait être le reflet d’une hyperexpression de STAT3 en réponse aux dommages de la barrière épithéliale notamment. Pour CDH1, cette méthylation pourrait être à l’origine d’une perte d’expression de l’E- cadhérine à la surface des entérocytes, responsable d’une hyperperméabilité de la barrière intestinale.

Crohn’s disease (CD) is characterized by an impaired immune response to intestinal microbiota, associated with an integrity loss of intestinal barrier in predisposed patients. Two genes of the immune response, implicated in CD pathogenesis and which regulation might involve DNA methylation caught our attention. The gene of transcription factor STAT3, expressed in naïve CD4 lymphocytes (CD4N), involved in signaling pathways in chronic inflammation and colorectal carcinogenesis. Also, the gene of IL2RA receptor, expressed in regulatory T cells (Treg), which number and function are reduced in CD inflammatory intestinal mucosa. We also studied epithelial permeability impairment in CD. CDH1 encodes for the E-cadherin protein which ensures intestinal barrier cohesion. Loss of CH1 expression was found significant in CD, and the mechanisms involved in CDH1 loss of expression could be explained by DNA methylation. The aim of this work was to compare the DNA methylation of several regions of interest in the STAT3, IL2RA and CDH1 Method: We collected peripheral blood and ileal mucosal samples from patients newly operated for ileal CD (CD group) and patients operated for non- inflammatory disease (control group). In PBMC, we sorted CD4N and Treg cells. DNA was extracted and we analyzed the methylation of several regions of interest in the STAT3, IL2RA, and CDH1 genes. For STAT3, methylation analysis of the 4 CG in the promoter and the 2 CGs in intron 1 was performed by pyrosequencing. The same was done for the analysis of the CG in the 4 regions of interest in the IL2RA promoter and one region of interest in intron 1. For CDH1, methylation of the CpG island in the promoter was studied by MSP and methylation of the CG in the 7th enhancer was performed by pyrosequencing. Results: STAT3 study: 14 samples (6 CD, 9 controls). There was a significant hypomethylation of the 4 promoter CG in the inflamed ileal mucosa compared to the normal ileal mucosa (p=0.02). There was a significant tissue-specific differential methylation between the methylation of CD4N from PBMC and that of the digestive mucosa, with hypomethylation of CG1 (p=0.03) and CG2 (p<0.01) in intron 1 (p=0.03). IL2RA study: 36 samples (17 CD, 19 controls). There was no significant difference in methylation of the CG in the 5 regions of interest of IL2RA between CD and controls. In the PRR IVr region, methylation of the 4 CG was positively correlated. In the PRR III region, methylation of the 4 CG (-3946, -3851, - 3789, -3691) was positively correlated, except for CG -3970. In the PRR I-II-NRE region, among the 6 CG, only CG -456, -373, -356 had positively correlated methylation. CDH1 study: 37 samples (21 CD, 16 controls). In the ileal mucosa, the CG island in the CDH1 promoter was methylated in 90% of CD samples compared to 50% of controls (p<0.01). In PBMC, there was no significant difference (52% of CD vs 44% of controls). Methylation of the 4 CG in the CDH1 enhancer was higher in CD (45±17% in CD vs 36±17% in controls, p<0.001), while it was comparable in PBMC. Conclusion: There is a significant association between methylation of STAT3 and CDH1 and ileal CD. For STAT3, this methylation could reflect an overexpression of STAT3 in response to epithelial barrier damage. For CDH1, this methylation could lead to loss of E-cadherin expression on enterocytes, resulting in increased permeability of the intestinal barrier.