Mise en évidence des mécanismes de formation tumorale associés à BRCA2, en utilisant deux variants pathogènes connus

Shedding light on the mechanisms of tumor formation linked to BRCA2 using two known pathogenic variants

• Auteur / Autrice : Anna Minello
• Direction : Aura Carreira
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 11/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Stoppa-Lyonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Josée Guirouilh-Barbat, Maaike Vreeswijk, Filippo Rosselli, Charles Theillet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Josée Guirouilh-Barbat, Maaike Vreeswijk

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines suppresseurs de tumeurs

Instabilité du génome

Protéine BRCA2

Haploinsuffisance

Cancérogenèse

ADN -- Réparation

Mots clés libres

Haploinsuffisance

Brca2

Instabilité génomique

Suppresseur de tumeurs

Réparation de l'ADN

Formation de tumeurs

Haploinsufficiency

Brca2

Genomic instability

Tumor suppressor

DNA repair

Tumor formation

Résumé

L'intégrité du génome de la cellule eucaryote est constamment menacée par des lésions de l'ADN causées soit par des facteurs externes, soit par le métabolisme cellulaire. Ces dommages pouvant avoir des conséquences néfastes, les cellules disposent de divers mécanismes de réparation des dommages de l'ADN : parmi eux, la recombinaison homologue (HR) est l'un des plus importants, car elle effectue une réparation de haute-fidélité des cassures double brin de l'ADN (DSB), des liaisons croisées inter-brins (ICL) ainsi que des lésions de l'ADN générées pendant la réplication en utilisant une séquence identique (la chromatide sœur) comme modèle. BRCA2 est une protéine suppresseur de tumeurs essentielle au maintien de l'intégrité du génome grâce à son rôle clé dans la voie de la HR. Par conséquent, les mutations mono-alléliques héréditaires de BRCA2 prédisposent au cancer du sein et de l'ovaire. Alors que les effets délétères de la déficience de BRCA2 sont connus, notamment les défauts de la HR, le stress réplicatif et l'accumulation de ponts d'ADN simple brin (ssDNA gaps), les mécanismes de formation des tumeurs chez les porteurs de mutations de BRCA2 restent mal définis. L'inactivation de l'allèle sauvage (perte d'hétérozygotie, LOH) semble être cruciale pour la carcinogenèse des cellules mutées de BRCA2. Cependant, certains cancers conservent le deuxième allèle intact, suggérant une haplo-insuffisance de BRCA2. Pour répondre à cette question, nous avons édité génétiquement deux lignées cellulaires isogéniques épithéliales mammaires non tumorales, chacune portant un variant pathogène mono­ allélique de BRCA2.L'analyse par RNA-seq a révélé que le variant c.771- 775del (del5) de BRCA2 avait un impact minimal sur l'expression génique tandis que le deuxième, le c.5946del (delT), entraînait des changements transcriptomiques substantiels, notamment la régulation négative de gènes liés à l'adhésion cellulaire. Les essais en soft-agar ont révélé que cette lignée avait une capacité accrue à former des colo­nies de manière indépendante de l'ancrage, indiquant un phénotype invasif, en accord avec les changements d'expression génique observés. Les cellules portant le variant del5 présentaient des niveaux protéiques réduits à la fois de BRCA2 et de son effecteur clé, RAD51. Cette réduction corréle avec des déficiences dans la réparation médiée par la HR et avec une sensibilité accrue aux inhibiteurs de PARP (PARPi) et au traitement à la Mitomycine C (MMC). De plus, les cellules +/del5 ont accumulé des ssDNA gaps en réponse au stress réplicatif induit par le PARPi, suggérant une instabilité génomique persistante dans cette lignée.Ensuite, pour comparer les deux variants dans un contexte tumoral, nous avons analysé, par séquençage complet du génome (WGS), des échantillons d'ADN de tumeurs mammaires primaires et de tissus non néoplasiques adjacents. De manière surprenante, malgré les différences observées dans les cellules porteuses de mutations hétérozygotes de BRCA2, nous avons observé des profils génomiques similaires, indicatifs d'une déficience en recombinaison homologue (HRD) dans les deux cohortes de tumeurs. De plus, lorsque nous avons analysé la proportion de tumeurs ayant subi une LOH de BRCA2, nous avons trouvé des fréquences différentes entre les deux cohortes, suggérant une pression sélective différente pour cet événement dans les tumeurs. En conclusion, notre travail suggère que différentes variants pathogènes mono-alléliques de BRCA2 conduisent à des profils transcriptomiques et phénotypiques différents. Ces disparités pourraient potentiellement expliquer la fréquence variable de LOH dans les tumeurs, tandis que leur signature mutationnelle est principalement attribuée à une HRD. Ceci pourrait avoir des implications cliniques significatives, affectant la réponse des tumeurs associées à BRCA2 aux traitements chimiothérapeutiques comme les PARPi, qui se sont avérés plus efficaces dans les cellules subissant une LOH de BRCA2.

The genome integrity of the eukaryotic cell is constantly threatened by DNA lesions, caused by external factors or endogenous by-products of cellular metabolism. As those damages could lead to harmful consequences, cells are provided with several DNA damage repair mechanisms: among them, homologous recombination (HR) is one of the most important as it operates a high-fidelity repair of DNA double-strand breaks (DSBs), inter-strand crosslinks (ICLs) and replicative DNA lesions using an identical sequence (the sister chromatid) as a template. BRCA2 is a tumor suppressor protein essential for maintaining genome integrity, especially through its key role in the HR pathway. As such, inherited BRCA2 mono-allelic mutations confer predisposition to breast and ovarian cancer. While the deleterious effects of BRCA2 deficiency are known, including HR defects, replication stress, and ssDNA gaps accumulation, the mechanisms driving tumor formation in BRCA2 mutation carriers remains ill defined. The inactivation of the wild-type allele (loss of heterozygosity, LOH) appears to be crucial for BRCA2-mutated cell carcinogenesis. Nonetheless, some cancers retain an intact second allele, suggesting that cells with a BRCA2 mono-allelic mutation may display a distinct genome instability phenotype, thereby pointing to BRCA2 haploinsufficiency. To address this question, we gene-edited two non- tumoral breast epithelial isogenic cell lines, each bearing a common truncating pathogenic mono- allelic BRCA2 variant. Using RNA-seq analysis, we demonstrated that the c.771-775del (del5) variant had a minimal impact on gene expression whereas the c.5946del (delT) variant led to substantial transcriptomic changes, notably the downregulation of cell adhesion-related genes. Soft agar assays revealed an increased ability of the latter to form colonies in an anchorage- independent manner, indicating an invasive phenotype, consistent with the gene expression changes observed. In stark contrast, +/del5 cells exhibited reduced levels of both BRCA2 and its key downstream effector, RAD51. This correlated with deficiencies in HR-mediated repair and increased sensitivity to PARP inhibitors (PARPi) and Mitomycin C (MMC) treatment. Furthermore, +/del5 cells accumulated ssDNA gaps in response to replication stress induced by PARPi, suggesting an ongoing genomic instability in this clone. Next, to compare the two variants in a tumor context, we analyzed the mutational pattern of DNA samples from primary breast tumors and non- neoplastic matched surrounding tissue bearing the same variants by Whole-Genome Sequencing (WGS). Surprisingly, despite the differences observed in cells with heterozygous BRCA2 mutations, we observed similar mutational profiles indicative of HR deficiency (HRD) in both sets of tumors. Interestingly, when we analyzed the proportion of tumors that underwent BRCA2 LOH, we found different frequencies between the two cohorts suggesting different selective pressure for this event to occur in the two sets of tumors. In conclusion, our work suggests that different BRCA2 pathogenic variants in heterozygosity lead to different transcriptomic and phenotypic outcomes. These differences potentially explain the variable frequency of LOH in tumors while suggesting that HRD is a predominant driver of BRCA-mutated cancer. Our findings could have significant clinical implications, for example, in predicting the response of BRCA2-associated tumors to chemotherapeutic drugs like PARPi, shown to be more efficient in cells undergoing LOH.