Rôle des tiges-boucles TAR et cTAR sur le premier transfert de brin du VIH-1

Role of TAR and cTAR stem-loops on HIV-1 first strand transfer

• Auteur / Autrice : Sandra Da Silva Amaral
• Direction : Philippe Fossé
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 30/03/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie et pharmacologie appliquée (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2002-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : École normale supérieure Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 1912-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Carine Tisné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Christophe Paillart, Hugues de Rocquigny, Nelly Morellet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Christophe Paillart, Hugues de Rocquigny

Mots clés

Mots clés contrôlés

VIH-1 (Virus de l'Immunodéficience Humaine de type 1)

Mots clés libres

Transcription inverse

Transfert de brin

ADN strong-Stop

Structure

VIH-1

Protéine de nucléocapside

Reverse transcription

HIV-1

Strand transfer

Structure

Strong-Stop DNA

Nucleocapsid protein

Résumé

Le cycle de vie du VIH-1 requiert le processus de transcription inverse. Ce processus permet la synthèse d'un ADN double-brin à partir du génome viral constitué de deux copies d'ARN simple-brin de polarité positive servant alors de matrice. Deux événements, appelés transferts de brin terminaux, sont nécessaires à la réalisation de la transcription inverse et donnent lieu chacun à la synthèse d'un des deux brins d'ADN. Mes travaux de thèse sont focalisés sur le premier transfert de brin. Celui-ci se produit de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' de l'ARN génomique viral (ARNg) au niveau des séquences R dupliquées et ce après la synthèse de l'ADN strong-stop (ADNss) par la transcriptase inverse (RT). L'ADNss étant une copie des régions R et U5 de l'extrémité́ 5' de l'ARNg, il peut s'apparier avec la région R présente aussi en 3' de l'ARN viral et permettre la synthèse du brin d'ADN de polarité négative. Les séquences des régions R forment deux tiges-boucles (cTAR et cpoly(A) dans l'ADNss, 3'TAR et 3'poly(A) dans l'ARNg). Ces structures doivent être ouverte pour permettre l'hybridation entre les régions R de l'ADNss et de l'ARNg. Plusieurs études in vitro suggèrent que la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NC) est en partie responsable de l'ouverture de ces tiges-boucles et de leur appariement. Cette protéine est connue pour son activité chaperon des acides nucléiques et est impliquée dans plusieurs étapes du cycle viral. Les travaux étudiant le rôle de la NC sur la transcription inverse ont montré notamment in vitro que cette protéine facilite le premier transfert de brin et en se fixant préférentiellement au niveau de certaines guanines déstabilise les tiges-boucles TAR et cTAR. Cette déstabilisation par la NC est dépendante du nombre de paires de bases consécutives impliquées dans la tige-boucle. Les travaux de thèse déterminent si ex vivo le premier transfert de brin dépend de la déstabilisation par la NC des tiges-boucles cTAR de l'ADNss et TAR de l'ARNg. Pour cela, différents types de mutations ont été conçues et introduites par mutagénèse dirigée dans les tiges-boucles afin d'empêcher leur déstabilisation par la NC et produire ainsi un effet négatif sur la transcription inverse. La réplication des virus mutés et plus précisément leur capacité à réaliser la transcription inverse de l'ARNg sont analysées et discutées.

The HIV-1 life cycle requires the reverse transcription process. This process allows the synthesis of a double-stranded DNA from its genome, which consists of two copies of single-stranded RNA of positive polarity used as a template. Two events, called terminal strand transfers, are necessary for reverse transcription to occur and each results in the synthesis of one of the two DNA strands. My thesis work focuses on the first strand transfer. This occurs from the 5' end to the 3' end of the viral genomic RNA (gRNA) at the duplicated R sequences after the synthesis of the strong-stop DNA (ssDNA) by the reverse transcriptase (RT). As ssDNA is a copy of the R and U5 regions of the 5' end́ of the gRNA, it can pair with the R region also present in the 3' of the viral RNA and allow synthesis of the negative polarity DNA strand. The sequences of the R regions form two stem-loops (cTAR and cpoly(A) in ssRNA, 3'TAR and 3'poly(A) in gRNA). These structures must be open to allow hybridization between the R regions of the ssDNA and RNA. Several in vitro studies suggest that the HIV-1 nucleocapsid protein (NC) is partly responsible for the opening of these stem-loops and their pairing. This protein is known for its chaperone nucleic activity and is involved in several steps of the viral cycle. The works studying the role of NC on reverse transcription showed in vitro that this protein facilitates the first strand transfer and destabilizes the TAR and cTAR stem-loops by binding to certain guanines. Furthermore, the destabilisation reaction by NC is dependent on the number of consecutive base pairs involved in the stem-loop. The thesis work determines whether the first strand transfer depends on the destabilisation of the ssDNA cTAR and the gRNA TAR stem-loops by NC ex vivo. To this end, different types of mutations were designed and introduced in these stem-loops to prevent their destabilisation by NC and to observe an effect on reverse transcription. Replication of mutant viruses and more precisely the reverse transcription of gRNA are analyzed and discussed.