Etude des conséquences d’une surexpression de la protéine Cycline A2 sur la croissance cellulaire et le maintien de l’intégrité du génome

Study of the consequences of CyclinA2 protein overexpression on cell growth and maintenance of genome integrity

• Auteur / Autrice : Marion Poteau
• Direction : Olivier Gavet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 13/03/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome et cancers (Villejuif, Val-de-Marne ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Clara Nahmias
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Clara Nahmias, Daniel Fisher, Helfrid Hochegger, Joëlle Sobczak
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Daniel Fisher, Helfrid Hochegger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cycline A

Prolifération cellulaire

Surexpression protéique

Génome

Cancérogenèse

Mots clés libres

Prolifération cellulaire

Cancer

Intégrité génétique

Surexpression d’inducteurs mitotiques

Cell proliferation

Cancer

Genetic integrity

Mitotic inducers overexpression

Résumé

Cycline A2 et Cycline E1/E2 sont deux régulateurs du cycle cellulaire impliqués dans l'initiation et l'exécution du processus de réplication de l'ADN, tandis que Cycline A2 est également requise pour l'entrée en la mitose. Cycline E interagit principalement avec Cdk2 pour favoriser la transition G1/S au cours de la croissance cellulaire normale, alors que dans les cellules déficientes pour Cdk2, elle a été décrite comme interagissait également avec Cdk1. Cycline A2 est exprimée dès le début de la phase S et interagit d'abord avec Cdk2, puis également avec Cdk1 à partir du milieu de la phase S, tandis que le niveau protéique de Cycline E diminue à mesure que la phase S progresse. Par conséquent, les deux Cyclines présentent une régulation, des propriétés ainsi que des fonctions biologiques semblables et il a été constaté qu'elles pouvaient se compenser l'une l'autre, du moins dans certains contextes. Cependant, seule Cycline E, et non Cycline A2, a été décrite agir comme un oncogène lorsqu'elle est dérégulée. De manière cohérente, la surexpression expérimentale de Cycline E chez la souris provoque des carcinomes hépatocellulaires et mammaires. Néanmoins, il a été signalé que Cycline A2, comme Cycline E, est surexprimée dans divers cancers humains, en corrélation avec l'agressivité des tumeurs. Pourtant, les essais de surexpression de Cycline A2 chez les rongeurs n'entrainent pas la formation de tumeurs. Par conséquent, la contribution potentielle et relative de la surexpression de Cycline A2 dans les cancers humains reste mystérieuse. Dans ce contexte, l'objectif de mon projet de thèse était d'étudier plus en détail les conséquences de la surexpression de Cycline A2 dans les cellules humaines en culture, sur la régulation de la progression du cycle cellulaire, le maintien de l'intégrité génétique et le devenir cellulaire. Dans ce but, j'ai généré des lignées cellulaires humaines stables surexprimant de façon conditionnelle Cycline A2WT ou une forme mutante dans un contexte génétique où p53 est fonctionnel ou déficient. Grâce à ces outils, j'ai découvert que la surexpression de Cycline A2 favorise une entrée prématurée des cellules en phase S accompagnée d'une diminution de la densité des fourches de réplication actives et de leur vitesse, montrés par des expériences de peignage moléculaire de l'ADN. Ce phénomène est associé à un stress réplicatif marqué qui ralentit la progression de la phase S et à une suractivation du point de contrôle de la réplication de l'ADN dépendant de la voie ATR/Chk1. En conséquence, une augmentation du nombre de régions d'ADN non-répliquées persistantes en mitose ainsi que des cassures chromosomiques ont été observées dans les cellules p53KO. Ces situations ont favorisé une ségrégation chromosomique incorrecte et l'apparition d'une descendance cellulaire présentant des micronoyaux. De plus, en l'absence d'une réponse fonctionnelle de p53, cela conduit lentement à l'accumulation de cellules aneuploïdes au cours des divisions cellulaires successives. Ensemble, mes résultats suggèrent que la surexpression de Cycline A2 observée dans diverses tumeurs, pourrait contribuer à alimenter les altérations et la diversité génétiques spécifiquement dans un contexte de déficience de p53, une situation courante dans plus de la moitié des cancers humains.

CyclinA2 and CyclinE1/E2 are two cell cycle regulators both involved in the initiation and execution of the DNA replication process, while CyclinA2 is also required for commitment into mitosis. CyclinE interacts primarily with Cdk2 to promote the G1/S transition during normal cell growth, while it has been found to also interact with Cdk1 in some Cdk2-deficient cells. CyclinA2 is expressed from S-phase onset and interacts first with Cdk2 and then also with Cdk1 from mid S-phase, while Cyclin E protein level decays as S-phase progresses. Hence, both Cyclins share related regulation, properties and biological functions and has been found to compensate for each other, at least in some contexts. However, only CyclinE, but not CyclinA2, has been described as an oncogene upon deregulation. Consistently, experimental CyclinE overexpression assays in mice induced hepatocellular and breast carcinomas. Nonetheless, CyclinA2, as CyclinE, has been reported to be overexpressed in various human cancers, which correlates with tumor aggressiveness. Yet, CyclinA2 overexpression assays in rodents did not promote tumor formation. Therefore, the potential and relative contribution of CyclinA2 overexpression in human cancers remains puzzling.In this context, the aim of my PhD project was to further investigate the consequences of CyclinA2 overexpression (OE) in human cells in culture, on the regulation of the cell cycle progression, the maintenance of the genetic integrity and cell outcome.To this end, I generated human stable cell lines conditionally overexpressing CyclinA2WT or a mutant form under both a p53 proficient or deficient genetic background. With these tools, I found that CyclinA2 OE promotes a premature entry of cells into S phase accompanied by a decrease in both the density of active replication forks and fork rate, as determined by DNA molecular combing assays. This was associated with a marked replication stress slowing down S-phase progression and an over-activation of ATR/Chk1-dependent DNA replication checkpoint. As a consequence, an increase of persistent under-replicated DNA regions at mitosis as well as mitotic chromosome breaks in p53KO cells was observed. These situations favored incorrect chromosome segregation and the appearance of a cell progeny exhibiting micronuclei. Moreover, in absence of a functional p53 response, this slowly leads to the accumulation of aneuploid cells over successive cell divisions.Together, my results suggest that CyclinA2 overexpression observed in various tumors, might contributes to fuel genetic alterations and diversity specifically in a p53 deficient context, a common situation in more than half of human cancers.