Résistance des tardigrades aux stress génotoxiques : Importance de la protection du génome et des systèmes de réparation de l’ADN

Resistance of tardigrades to genotoxic stress : Importance of genome protection and DNA repair systems

• Auteur / Autrice : Marwan Anoud
• Direction : Carine Giovannangeli, Jean-Paul Concordet, Anne De Cian
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 24/02/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure et Instabilité des Génomes - Structure et Instabilité des Génomes
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Mireille Bétermier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mireille Bétermier, Karine Van Doninck, Éric Röttinger, Roberto Guidetti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Karine Van Doninck, Éric Röttinger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Extrêmophiles

Réparation de l'ADN

Radiotolérance

Microorganismes des milieux extrêmes

Interactions ADN-protéine

Transcriptome

Protéomique

Tardigrades

Mots clés libres

Tardigrade

Radiotolérance

Réparation de l'ADN

Proméomique

Transcriptomique

Dsup

Tardigrade

Radiotolerance

DNA repair

Proteomics

Transcriptomics

Dsup

Résumé

Les tardigrades sont de petits métazoaires aquatiques capables de résister à une grande variété de conditions abiotiques extrêmes ; en particulier, la dessiccation et les rayonnements ionisants qui peuvent induire de nombreux dommages à l’ADN et menacer l’intégrité du génome. Chez le tardigrade Ramazzottius varieornatus, une protéine appelée RvDSup (pour R. varieornatus DNA Damage Suppressor), semble capable protéger le génome des rayons X. Afin de mieux comprendre leurs mécanismes de résistance aux dommages de l’ADN induits par les rayonnements ionisants, nous avons choisi de nous intéresser à trois espèces de tardigrades : Hypsibius exemplaris, dont le génome est séquencé ainsi qu’Acutuncus antarcticus et Paramacrobiotus fairbanksi, encore peu étudiés et dont les génomes sont en cours de séquençage. Les cassures simple brin de l’ADN induites par des doses de 100 et 1000 Gy de rayonnements γ ont été analysées chez H. exemplaris par migration de l’ADN génomique sur gel d’agarose dénaturant et les cassures double brin par Western blot avec un anticorps spécifique de la forme phosphorylée d’une histone H2AX. Ces analyses ont confirmé que les dommages de l’ADN sont dépendants de la dose administrée et sont majoritairement réparés 72 h après irradiation. Pour identifier les mécanismes impliqués dans la résistance des tardigrades, nous avons mesuré les changements de l’expression des gènes en réponse aux rayonnements γ et à la bléomycine, un antibiotique radiomimétique, par RNA-seq. Ces analyses nous ont permis d'identifier un ensemble de gènes très fortement surexprimés en réponse aux deux traitements et ceci dans les 3 espèces analysées. Nous avons complété cette analyse du transcriptome par une analyse protéomique chez H. exemplaris, ce qui a permis de confirmer qu’un grand nombre de gènes induits au niveau ARNm sont également induits au niveau protéique. Parmi ces gènes, on retrouve de nombreux gènes des voies classiques de la réparation des cassures double brin de l’ADN (NHEJ, HR, MMEJ) mais aussi des gènes de fonctions inconnues qui semblent uniques aux tardigrades. Ces gènes sont des gènes candidats de la résistance aux rayonnements γ des tardigrades dont nous avons choisi d’étudier la fonction. Pour cela, nous avons réalisé des expériences de gain de fonction par expression hétérologue dans des cellules humaines de la lignée U2OS, qui nous ont permis d’identifier leur localisation subcellulaire et de tester leur capacité à conférer une résistance aux stress génotoxiques en mesurant le nombre de foyers phospho-H2AX induits après traitement à la bléomycine. En particulier, un des gènes testés, qui a été appelé TDR1 (pour Tardigrade DNA damage resistance 1 gene), est capable de diminuer le nombre de foyers phospho-H2AX induits par la bléomycine, et ceci de manière au moins aussi importante que la protéine RvDsup précédemment décrite. De façon remarquable, cette propriété est commune aux 4 orthologues potentiels de TDR1 testés, suggérant que nous avons mis à jour un nouvel acteur important de la résistance des tardigrades aux rayonnements γ. Différentes approches biochimiques et de génomique fonctionnelle, comme l’invalidation des gènes par CRISPR/Cas9, devraient permettre de mieux comprendre leurs mécanismes d’action et confirmer leur activité dans la résistance des tardigrades.

Tardigrades are small aquatic metazoans capable of withstanding a wide variety of extreme abiotic conditions; in particular, desiccation and ionizing radiation which can induce extensive DNA damage and threaten genome integrity. In the tardigrade Ramazzottius varieornatus, a protein called RvDSup (for R. varieornatus DNA Damage Suppressor), is thought to protect the genome from X-rays. In order to better understand the resistance to DNA damage induced by ionizing radiation, we chose to focus on three tardigrade species: Hypsibius exemplaris, whose genome has been sequenced, Acutuncus antarcticus and Paramacrobiotus fairbanksi, which are still little studied and whose genomes are being sequenced. DNA single-strand breaks induced by doses of 100 or 1000 Gy of γ- radiation were analyzed in H exemplaris by migration of genomic DNA on denaturing agarose gel and double-strand breaks by Western blot with an antibody specific for the phosphorylated form of a histone H2AX of H. exemplaris. These analyses confirmed that DNA damage is dose dependent and is mostly repaired 72 h after irradiation. To identify mechanisms involved in tardigrade resistance, we measured changes in gene expression in response to γ-radiation and bleomycin, a radiomimetic antibiotic, by RNA-seq. These analyses allowed us to identify a set of genes highly overexpressed in response to both treatments in all 3 species analyzed. We completed this transcriptome analysis with a proteomic analysis in H. exemplaris, which confirmed that a large number of genes induced at the mRNA level are also induced at the protein level. These genes include many genes from the classical DNA double-strand break repair pathways (NHEJ, HR, MMEJ) but also genes of unknown function that appear to be unique to tardigrades. These genes are candidate genes for γ-radiation resistance in tardigrades whose function we chose to study. To this end, we performed gain-of- function experiments by heterologous expression in human U2OS cells, which allowed us to identify their subcellular localization and to test their ability to confer resistance to genotoxic stress by measuring the number of phospho-H2AX foci induced after bleomycin treatment. In particular, one of the genes tested, which was named TDR1 (for Tardigrade DNA damage resistance 1 gene), is able to decrease the number of phospho-H2AX foci induced by bleomycin, and this in a way that is at least as important as the previously described RvDsup protein. Remarkably, this property is common to all 4 potential TDR1 orthologs tested, suggesting that we have uncovered an important new player in tardigrade resistance to γ-radiation. Different biochemical and functional genomics approaches, such as gene invalidation by CRISPR/Cas9, should allow to better understand their mechanisms of action and confirm their role in tardigrade resistance.