Approche thérapeutique par suppression traductionnelle de mutations non-sens dans le gène CFTR

Therapeutic approach by translational suppression of nonsense mutations in the CFTR gene

• Auteur / Autrice : Sabrina Karri
• Direction : Olivier Namy, Laure Bidou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 22/02/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuel Gonzales
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Valérie Allamand, Valérie Heurgue Hamard, Frédéric Catez
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Valérie Allamand, Valérie Heurgue Hamard

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN de transfert

Codon stop

Mucoviscidose

Mots clés libres

CFTR

Mucoviscidose

ARNt

Traduction

Translecture

Mutation non-sens / codon stop prématuré

CFTR

Cystic fibrosis

.tRNA

Translation

Readthrough

Nonsense mutation / premature termination codon

Résumé

Les mutations non-sens représentent 12 % des cas de mucoviscidose. Ces mutations apparaissent suite à une mutation spontanée qui crée un codon stop en phase (UAA, UAG, UGA), ce qui provoque l'arrêt précoce de la traduction. Ceci entraîne la synthèse d'une protéine tronquée qui ne pourra pas assurer sa fonction cellulaire normale. Ces dernières années, l'approche par suppression traductionnelle s'est beaucoup développée (aussi appelée translecture du codon stop). Le principe est d'utiliser une molécule qui va permettre au ribosome de ne pas reconnaître le codon stop prématuré (ou PTC pour Premature Termination Codon) mais de poursuivre la traduction jusqu'au codon stop normal du gène. La mucoviscidose est un bon model d'étude pour développer cette stratégie thérapeutique, car une restauration fonctionnelle de 10 à 20% est suffisante pour obtenir un bénéfice clinique. Parmi les molécules induisant la translecture, les plus étudiées sont les aminoglycosides comme la gentamicine mais leur utilisation reste limitée en raison de leurs effets néphrotoxiques et d'un spectre d'action restreint à certaines mutations. La caractérisation de nouvelles molécules permettant le développement d'une thérapie de translecture efficace sur les mutants CFTR constitue donc un enjeu majeur. Pour ces raisons, de nombreuses équipes, incluant la nôtre, ont développé des programmes pour identifier des nouvelles molécules inductrices de translecture. Ceci nous a permis d'identifier un nouvel inducteur de translecture nommé TLN468 et son dérivé chimique EC-288. Ces nouvelles molécules permettent d'obtenir des efficacités de translecture supérieures à celles obtenues en présence de gentamicine et présentent une spécificité d'action différente des aminoglycosides. Obtenir une protéine entière est évidemment essentiel au succès de la thérapie, mais la ré-expression d'une protéine CFTR par translecture peut engendrer l'expression d'une protéine contenant un acide aminé ne permettant pas une activité optimale de la protéine (équivalent à une mutation faux-sens). Ainsi, pour mettre au point une thérapie de translecture efficace, il est important de prédire quels PTC répondront correctement à un traitement par un inducteur de translecture, c'est-à-dire que leur translecture aboutira à la production d'une quantité suffisante de protéine fonctionnelle. Pour cela, j'ai identifié les acides aminés incorporés au niveau des PTCs du gène CFTR S1196X, G542X, W846X et E1418X lors de la suppression traductionnelle basale ou induite par la TLN468 et l'EC-288. Les résultats de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les acides aminés Gln, Tyr, Lys et Leu au niveau des codons UAA et UAG, et les acides aminés Trp, Arg, Cys et Ser au niveau du codon UGA. Il est intéressant de noter que le traitement par la TLN468 ou l'EC-288 augmente fortement l'incorporation d'un seul acide aminé pour chacun des codon stop, ce qui suggère un mécanisme d'action très spécifique. L'activité des canaux CFTR recodés prédits correspondant aux 4 PTCs étudiés a ensuite été mesurée avec ou sans potentiateur. Certaines protéines CFTR générées par la suppression des PTC ont une maturation et une activité proche de la protéine sauvage, mais d'autres ont une activité réduite ce qui indique la complexité de la thérapie de suppression traductionnelle. Cependant, le potentiateur de CFTR augmente parfois l'activité des canaux recodés. Ces résultats suggèrent que la suppression du PTC en combinaison avec des modulateurs de CFTR peut être bénéfique pour le traitement des patients atteints de mucoviscidose avec PTC.

Nonsense mutations account for 12% of cystic fibrosis cases. These mutations occur as a result of a spontaneous mutation that creates an in-frame stop codon (UAA, UAG, UGA), which causes an early translational arrest. This leads to the synthesis of a truncated protein that will not be able to perform its normal cellular function. In the last few years, the translational suppression approach (also called stop codon readthrough) has been widely developed. The principle is to use a molecule that will allow the ribosome not to recognize the premature termination codon (PTC) but to continue the translation to the normal stop codon of the gene. Cystic fibrosis is a good model for the development of this therapeutic strategy because a functional restoration of 10 to 20% is sufficient to obtain a clinical benefit. Among the molecules inducing readthrough, the most studied are the aminoglycosides like gentamicin but their use remains limited because of their nephrotoxic effects and limited range of action to certain mutations. The characterization of new molecules allowing the development of an efficient readthrough therapy on CFTR is therefore a major challenge. For these reasons, many teams, including ours, tried to identify new readthrough inducers. This allowed us to identify a new one named TLN468 and its chemical derivative EC-288. These new molecules allow us to obtain a higher efficiency of readthrough than those obtained in the presence of gentamicin and present a specificity of action different from aminoglycosides. Obtaining a whole protein is obviously essential to the success of the therapy, but the re-expression of a CFTR protein by readthrough may result in the expression of a protein containing an amino acid that does not allow optimal activity of the protein (equivalent to a missense mutation). Thus, in order to develop an effective readthrough therapy, it is important to predict which PTCs will respond correctly to treatment with a readthrough inducer, i.e. that their readthrough will result in the production of a sufficient amount of functional protein. To do this, I identified the amino acids incorporated at the CFTR gene PTCs S1196X, G542X, W846X and E1418X during TLN468 and EC-288 mediated translational suppression by mass spectrometry. The results showed that the amino acids Gln, Tyr, Lys, and Leu are incorporated at the UAA and UAG codons, and the amino acids Trp, Arg, Cys, and Ser are incorporated at the UGA codon. It is interesting to note that TLN468 and EC-288 significantly increase the incorporation of only one amino acid suggesting a very specific mechanism of action. The function of the predicted recoded CFTR channels corresponding to the 4 PTCs studied was therefore measured with or without potentiator. Some CFTR proteins generated by PTC suppression have maturation and activity close to the wild-type protein but some are reduced, underlying the complexity of the translational readthrough therapy. However, CFTR potentiator sometimes increases the activity of recoded channels. These results suggest that PTC readthrough in combination with CFTR modulators may be beneficial for the treatment of cystic fibrosis patients with PTC.