Quantification multiplexe de biomarqueurs et de leurs protéoformes par spectrométrie de masse pour le diagnostic différentiel de maladies neurodégénératives

Multiplex quantification of biomarkers and their proteoforms by mass spectrometry for the differential diagnosis of neurodegenerative diseases

• Auteur / Autrice : Chloé Jacquemin
• Direction : François Becher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 26/01/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et technologies pour la santé (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Claire Smadja
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Claude Potier, Pauline Poinot, Dominique Bonnefont-Rousselot, Nicolas Villain, Foudil Lamari
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Claude Potier, Pauline Poinot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Maladies neurodégénératives

Liquide cérébro-spinal

Spectrométrie de masse avec ionisation électrospray

Marqueurs biologiques

Diagnostic différentiel

Mots clés libres

Diagnostic différentiel

Biomarqueurs BMs

Spectrométrie de masse

Liquide céphalo-rachidien LCR

Maladies neurodégénératives MNDs

Protéoformes

Differential diagnosis

Biomarkers BMs

Mass spectrometry

Cerebrospinal fluid CSF

Neurodegenerative diseases NDDs

Proteoforms

Résumé

Les maladies neurodégénératives (MNDs) sont un véritable enjeu actuel. Peu de traitements sont disponibles et le diagnostic est difficile à réaliser, notamment aux stades précoces où les éléments cliniques de ces pathologies sont très similaires. De plus, très peu de biomarqueurs (BMs) biologiques sont validés à ce jour. En effet, seule la protéine tau phosphorylée sur la thréonine 181 (p-tau181) et le rapport amyloïde beta40/beta42 sont utilisés en clinique dans le cas de la Maladie d'Alzheimer (MA). Cependant, il n'existe toujours pas de BM pour distinguer cette dernière des autres tauopathies. Il en est de même pour la distinction entre les diverses synucléinopathies. La recherche de nouveaux BMs en vue d'établir des signatures caractéristiques des diverses MNDs est donc cruciale pour un diagnostic différentiel précis. Dans le cas des MNDs, le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un échantillon biologique de choix, puisqu'en connexion directe avec le cerveau. Ainsi, trois protéines du LCR et impliquées dans la physiopathologie de diverses MNDs ont été ciblées durant ce travail de thèse : la protéine tau, l'alpha-synucléine et TDP-43. Ces protéines existent sous différentes formes (protéoformes) en fonction des diverses modifications post-traductionnelles (PTMs) subies (troncations, phosphorylations, acétylations, …). Pour chacune des 3 protéines ciblées, les PTMs majeures en lien avec le déclenchement et l'évolution de leurs MNDs associées ont été recherchées dans la littérature, et une liste des PTMs à mesurer dans le LCR a été établie. La faible concentration dans le LCR et la diversité des protéoformes sélectionnés requiert l'utilisation d'une méthode d'analyse sensible et multiplexe. La spectrométrie de masse à haute résolution couplée à une chaine de chromatographie liquide (LC-HRMS) a donc été choisie à cet effet. L'analyse sensible de protéines et protéoformes par LC-HRMS nécessite au préalable une préparation d'échantillon permettant d'extraire et d'enrichir les protéines d'intérêt. Ainsi parmi les méthodes de la littérature, deux approches ont été retenues pour l'alpha-synucléine et tau : la première basée sur l'utilisation d'anticorps (Acs) (immunocapture - IC), la deuxième associant une précipitation des protéines et une extraction par µSPE (Prec-µSPE). Ces deux approches ont été optimisées de manière à atteindre la sensibilité la plus élevée possible pour les trois protéines ciblées puis évaluées sur des échantillons de LCR artificiel (surchargé avec des protéines recombinantes) et des pools de LCRs issus de patients. La première approche permet une sensibilité accrue grâce à l'enrichissement sélectif par les Acs. La deuxième, permet quant à elle de s'affranchir totalement de l'utilisation d'anticorps, et ainsi de détecter un plus grand nombre de protéoformes. Enfin, seule l'IC a pu être évaluée pour TDP-43, ses propriétés physico-chimiques ne permettant pas une extraction sélective par la technique de Prec-µSPE. In fine, l'intérêt diagnostic des deux méthodes (IC et Prec-µSPE) a été évalué avec l'analyse de LCRs issus d'une cohorte de patients atteints de diverses MNDs pures (Cohorte Socrates, constituée par les cliniciens de l'IM2A à la Pitié Salpêtrière). Les formes totales et les protéoformes détectables par les approches IC et Prec-µSPE ont été quantifiées dans ces échantillons, afin de les confronter aux données cliniques et d'imagerie médicale.

Neurodegenerative diseases (NDDs) (MNDs) are an important current issue. Few treatments are available and the diagnosis is hard to achieve, especially at the early stages, where the clinical aspects of these diseases are very similar. Furthermore, very few biological biomarkers (BMs) are validated for clinical use to this day: only the tau protein phosphorylated on threonine 181 (p-tau181) and the amyloid beta40/beta42 ratio are used in clinics for Alzheimer's disease (AD). However, there is still no BM to differentiate AD from other tauopathies, or for the distinction between the different synucleinopathies. Research for new BMs to establish characteristic signatures for the various NDDs is essential for an accurate differential diagnosis. For NDDs, cerebrospinal fluid (CSF) is a choice biological sample, as is it in direct connexion with the brain. Thus, three proteins found in CSF and implied in the pathophysiology of multiple NDDs have been targeted during this thesis: tau protein, alpha-synuclein, and TDP-43. These proteins exist in different forms (proteoforms), according to the various post-translational modifications (PTMs) underwent (truncations, phosphorylations, acetylations, …). For each of these 3 targeted proteins, the major PTMs which are linked to the triggering and to the evolution of their associated NDD were searched in the literature, and a list of PTMs to be measured in CSF has been established. The low concentration in CSF and the diversity of the selected proteoforms requires the use of a sensitive and multiplex analysis method. For this, high-resolution mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC-HRMS) has been selected. Sensitive analysis of proteins and proteoforms with LC-HRMS needs a sample preparation allowing extraction and enrichment of the protein of interest. Among the methods found in the literature, two approaches have been retained for alpha-synuclein and tau: the first is based on the use of antibodies (Abs) (immunoprecipitation - IP), and the second combines protein precipitation with extraction by µSPE (Prec-µSPE). These two approaches were optimized in order to obtain the best sensitivity for the targeted proteins. They were then evaluated on artificial CSF samples (spiked with recombinant tau) and on pools of human CSF. The first method allows for an increased sensitivity due to the Abs's selective enrichment. The second does not use any Abs and thus allows for the detection of more proteoforms. Finally, only IP could be evaluated for TDP-43, as its physicochemical properties are not compatible with a selective extraction by Prec-µSPE. In the end, the pertinence for diagnosis was evaluated for the two methods (IP and Prec-µSPE) with the analysis of CSFs from a cohort of patients affected by various pure NDDs (Socrates Cohort, constituted by clinicians from IM2A institute, in the Pitié Salpêtrière hospital). Total forms and proteoforms detectable by IP and Prec-µSPE were quantified in these samples, in order to be confronted with clinical and medical imaging data.