Biologie synthétique de la fixation du carbone chez Chlamydomonas reinhardtii

Synthetic biology of carbon fixation in Chlamydomonas reinhardtii

• Auteur / Autrice : Nicolas Boisset
• Direction : Stéphane Lemaire, Pierre Crozet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 03/07/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie computationnelle et quantitative (Paris ; 2011-....) - Laboratoire Biologie moléculaire et cellulaire des eucaryotes (Paris ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Marianne Delarue
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nicolas Rouhier, Arnould Savouré, Katia Wostrikoff, Emmanuelle Issakidis-Bourguet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nicolas Rouhier, Arnould Savouré

Mots clés

Mots clés contrôlés

Photosynthèse

Enzymes -- Métabolisme

Antibiotiques

Biologie de synthèse

Chlamydomonas reinhardtii

Mots clés libres

Cycle de Calvin-Benson-Bassham

Chlamydomonas reinhardtii

Biologie synthétique

Photosynthèse

Phosphoribulokinase

Blasticidine

Chlamydomonas reinhardtii

Synthetic Biology

Calvin-Benson-Bassham Cycle

Photosynthesis

Phosphoribulokinase

Blasticidine

Résumé

La photosynthèse permet l'assimilation du CO₂ atmosphérique en glucides tout en produisant de l'O₂. L'énergie lumineuse est convertie en énergie chimique qui est à son tour principalement utilisée pour fixer le carbone inorganique via le cycle de Calvin-Benson-Bassham (CBBC). Le CBBC est composé de 13 réactions qui sont catalysées par 11 enzymes, qui sont toutes fortement exprimées et étroitement régulées à plusieurs niveaux (i.e. abondance, modifications post-traductionnelles). Le principal facteur limitant de la photosynthèse est le CBBC, qui présente des goulets d'étranglement cinétiques. Une meilleure compréhension de ces goulots d'étranglement in vivo est indispensable pour débloquer ces facteurs limitants pour pouvoir améliorer la photosynthèse. Une approche consiste à modifier leur abondance pour déterminer si l'enzyme correspondante est limitante. Pour contrôler l'abondance des enzymes CBBC in vivo, des circuits génétiques synthétiques peuvent être utilisés. Les approches de biologie synthétique permettent de construire de tels circuits génétiques et de comprendre par construction plutôt que par déconstruction. Dans ma thèse, nous avons choisi de travailler sur la Phosphoribulokinase (PRK) car son activité est unique et spécifique au CBNC, elle est codée par un seul gène nucléaire et un mutant est disponible chez l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. Nous démontrons l'importance de la PRK dans le processus de phototrophie par la caractérisation du mutant PRK. La complémentation fonctionnelle de ce mutant PRK a confirmé que ce phénotype était dû à son absence et qu'une modulation de la quantité de PRK in vivo était possible. Cependant pour obtenir plus de 40 % de PRK par rapport à la souche sauvage, nous avons dû construire un circuit génétique contenant le promoteur, 5'UTR et la séquence incluant les introns du gène de la PRK endogène. Les résultats obtenus lors de ma thèse suggèrent que la PRK n'est pas limitante chez C. reinhardtii. Dans des conditions autotrophes, à 40% de PRK, la complémentation n'est pas suffisante pour restaurer complètement la phototrophie, et il s'avère difficile d'obtenir un phénotype sauvage. La surexpression de PRK chez Chlamydomonas n'augmente pas la croissance suggérant que ce n'est peut-être pas en jouant la quantité de la PRK que nous pourrions améliorer la photosynthèse mais sur ses régulations.En parallèle de cela, j'ai participé au développement d'outils de biologie synthétique. En particulier, nous avons développé et validé un nouveau gène de résistance à l'antibiotique Blasticidine chez C. reinhardtii afin de faciliter la construction de nouvelles souches.

Photosynthesis allows the assimilation of atmospheric CO₂ into carbohydrates while producing O₂. Light energy is converted into chemical energy which in turn is primarily used to fix inorganic carbon via the Calvin Benson Bassham cycle (CBBC). The CBBC is composed of 13 reactions that are catalyzed by 11 enzymes, all of which are highly expressed and tightly regulated at several levels (i.e. abundance, post-translational modifications). The major limiting factor in photosynthesis is CBBC, which has kinetic bottlenecks. A better understanding of these bottlenecks in vivo is essential to unlock these limiting factors improve photosynthesis. One approach is to alter their abundance to determine whether the corresponding enzyme is limiting. To control the abundance of CBBC enzymes in vivo, synthetic genetic circuits can be used. Synthetic biology approaches allow such genetic circuits to be constructed and understood by construction rather than deconstruction. In my thesis, we chose to work on Phosphoribulokinase (PRK) because its activity is unique and specific to CBBC, it is encoded by a single nuclear gene and a mutant is available in the unicellular algae Chlamydomonas reinhardtii. We demonstrate the importance of PRK in the phototrophy process by characterizing the PRK mutant. Functional complementation of this PRK mutant confirmed that this phenotype was due to its absence and that modulation of PRK amount in vivo was possible. However, to obtain more than 40% of PRK compared to the wild type we had to construct a genetic circuit containing the promoter, 5'UTR and the sequence including the introns of the endogenous PRK gene. The results obtained during my thesis suggest that PRK is not limiting in C. reinhardtii. Under autotrophic conditions, at 40% PRK, the complementation is not sufficient to fully restore phototrophy, and it appears difficult to obtain a wild type phenotype even with more than 40% of PRK content. Overexpression of PRK in Chlamydomonas does not increase growth suggesting that it is perhaps not by playing on the quantity of PRK that we could improve photosynthesis but on its regulations.In parallel, I participated in the development of synthetic biology tools. In particular, we developed and validated a new gene for resistance to the antibiotic Blasticidin in C. reinhardtii in order to facilitate the construction of new strains.