Études fonctionnelles et structurales de deux pompes d'efflux ABC tripartites de type VII des bactéries à Gram-négatif

Functional and structural studies of two ABC type VII tripartite efflux pumps from Gram-negative bacteria

• Auteur / Autrice : William Batista dos Santos
• Direction : Martin Picard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 12/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Schalk
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gilles Phan, Muriel Masi, Elise Kaplan
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Schalk, Romé Voulhoux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sidérophores

Résistance aux antibiotiques

Transporteurs ABC

Pompes d'efflux

Protéines membranaires

Bactéries Gram négatives

Biochimie

Mots clés libres

Biochimie

Bactérie

Protéines membranaires

Pompe d'efflux

ABC transporteur

Structure-fonction

Résistance antibiotiques

Sidérophore

Biochemistry

Bacteria

Membrane proteins

Efflux pump

ABC transporter

Structure-function

Antibiotic resistance

Siderophore

Résumé

Chez les bactéries à Gram négatif, une double membrane lipidique fait partie d'une barrière complexe qui protège contre les menaces extracellulaires. Cette double membrane représente également un défi biologique pour le transport de molécules hors de la bactérie. Les pompes d'efflux tripartites sont des nanomachines bactériennes qui traversent les deux membranes et elles s'organisent autour d'un transporteur de la membrane interne, avec une protéine adaptatrice périplasmique reliant le transporteur à une porine de la membrane externe. MacB et PvdT sont des transporteurs d'intérêt appartenant au type VII de la superfamille des transporteurs ATP-Binding Cassette (ABC) et forment les pompes d'efflux tripartites homologues MacAB TolC chez Escherichia coli et PvdRT OpmQ chez Pseudomonas aeruginosa. MacAB TolC joue un rôle significatif dans la survie et la pathogénicité d'E. coli en sécrétant une toxine : l'entérotoxine de type II thermostable ainsi que des molécules de protoporphyrine IX. Un deuxième rôle de reconnaissance et d'efflux de certains macrolides a été démontré lorsque la bactérie ne possède pas la pompe d'efflux AcrAB, cruciale pour l'efflux d'antibiotiques. PvdRT OpmQ permet à P. aeruginosa de sécréter la pyoverdine (PVD), un sidérophore impliqué dans la capture du fer dans l'environnement extracellulaire. Bien que les rôles fonctionnels de ces protéines soient assez bien compris, les aspects mécanistiques du transport ne sont toujours pas très bien compris pour les transporteurs ABC de type VII. Une combinaison d'expériences fonctionnelles et structurales permet de suggérer des modèles de cycles catalytiques qui décrivent leur fonctionnement probable. Durant ma thèse, j'ai contribué à une première étude sur MacAB TolC reconstituée dans des environnements lipidiques permettant la mesure des deux fonctions de ce complexe : l'hydrolyse de l'ATP et l'activité de transport du substrat. J'observe que ces deux évènements sont concomitants dans le temps et je propose ainsi un rôle de l'hydrolyse de l'ATP dans l'efflux de substrat par MacAB TolC. Ces résultats permettent une discussion plus approfondie sur le cycle catalytique de cette pompe et ses événements critiques. J'ai également mené une deuxième étude sur MacAB TolC qui s'intéresse aux effets allostériques sur l'activité d'hydrolyse de l'ATP de MacB. J'ai confirmé dans un premier temps ce que nous apporte la littérature : MacA augmente l'activité ATPasique de MacB. Et dans un second temps, je montre que TolC augmente encore plus l'activité de MacB en présence de MacA. La reconstitution des protéines dans des environnements lipidiques augmente l'activité de MacB en présence de MacA ou de MacA et TolC. Le macrolide érythromycine, substrat de la pompe, augmente également l'activité de MacB dans différentes conditions. Ces résultats nous permettent de réexaminer les données structurales disponibles dans la littérature. Enfin, j'ai mis au point la production des trois composants de la pompe d'efflux tripartite PvdRT OpmQ ce qui permet leur étude fonctionnelle et structurale. Je montre que PvdT est une protéine active dans des micelles de détergent et la présence de PVD ou de lipides a un effet activateur dans la capacité de PvdT à hydrolyser l'ATP. J'ai également obtenu des résultats structuraux préliminaires de PvdRT avec un modèle in silico construit par collaboration et combiné à des résultats de microscopie à coloration négative. Cela ouvre des perspectives de recherche pour sa future étude structurale en utilisant la cryo-microscopie électronique à particule unique.

In Gram-negative bacteria, a double lipid membrane acts as a complex barrier that provides protection against extracellular threats. This double membrane presents a biological challenge for the transport of molecules out of the bacterium. Tripartite efflux pumps are bacterial nanomachines that span both membranes and are organized around an inner membrane transporter, with an assembly of periplasmic adaptors proteins and an outer membrane porin. MacB and PvdT are transporters belonging to the type VII of ATP-Binding Cassette (ABC) transporters superfamily and form tripartite efflux pumps, MacAB TolC in Escherichia coli and PvdRT OpmQ in Pseudomonas aeruginosa. MacAB TolC plays a significant role in the survival and pathogenicity of E. coli by secreting the heat-stable enterotoxin type II as well as molecules of protoporphyrin IX. A role in the recognition and efflux of certain macrolides has also been demonstrated when the bacterium lacks the AcrAB efflux pump, which is crucial for antibiotic efflux. PvdRT OpmQ allows P. aeruginosa to secrete pyoverdine (PVD), a siderophore involved in capturing iron from the extracellular environment. While the functional roles of these proteins are relatively well studied, the mechanistic details of transport are lacking for type VII ABC transporters. Our approach combines functional and structural experiments has led to describe their functioning by designing their catalytic cycles models. During my thesis, I contributed to an initial study of reconstituted MacAB TolC in lipid environments that enabled the measurement of both functions of this complex: ATP hydrolysis and substrate transport activity. I observed that these two events are concomitant, suggesting a role for ATP hydrolysis in substrate efflux by MacAB TolC. These results facilitate a more in-depth discussion of the catalytic cycle of this pump and its critical events. I also conducted a second study on MacAB TolC, which focuses on allosteric effects of the diferents partners of the tripartite complex on the ATP hydrolysis activity. We first confirmed that MacA enhances the ATPase activity of MacB and we also show, for the first time, that TolC induces an additional activation of MacB activity in the presence of MacA. Reconstitution of the proteins in lipid environments increases MacB ATP hydrolysis activity in the presence of MacA or both MacA and TolC. The macrolide erythromycin, a pump substrate, also enhances ATPase activity of MacB under different conditions. These results are interpreted in the light of the available structural data re-examination. Finally, I established the production of the three components of the tripartite efflux pump PvdRT OpmQ, enabling their functional and structural study. I showed that PvdT is an active protein in detergent micelles, and the presence of pyoverdine or lipids has an activating effect on PvdT ATPase activity. I also obtained preliminary structural results of PvdRT by negative-staining microscopy combined with using an in silico model developed in collaboration. This opens up research prospects for its future structural study using single-particle cryo-electron microscopy.