Utilisation de Gastruloïdes 2D de souris pour l'étude in vitro des voies de signalisation BMP, WNT et NODAL lors de la formation et la spécification de la ligne primitive

In vitro study of BMP, WNT and NODAL signalling pathways during primitive streak formation and specification using mouse 2D Gastruloids

• Auteur / Autrice : Gaël Simon
• Direction : Jérôme Collignon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Développement
• Date : Soutenance le 19/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jacques Monod (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Michel Cohen-Tannoudji
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antonio Scialdone
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Migeotte, Anne Camus

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse en cellule unique

Ligne primitive

Gastrulation

Mots clés libres

Souris

Gastrulation

Ligne Primitive

Gastruloïdes 2D

BMP

WNT

NODAL

SMAD4

Séquençage ARN en Cellules Uniques

Mouse

Gastrulation

Primitive Streak

2D Gastruloids

BMP

WNT

NODAL

SMAD4

Single Cell RNA Sequencing

Résumé

La gastrulation est la période où, chez tous les embryons amniotes, l'épiblaste pluripotent donne naissance aux cellules germinales primordiales (CGP) et aux trois feuillets embryonnaires : l'ectoderme, l'endoderme et le mésoderme, dont dérivent tous les tissus fœtaux. Chez l'embryon de souris, elle commence au jour embryonnaire 6,5 avec la formation de la ligne primitive (LP) dans l'épiblaste postérieur, à partir de laquelle les cellules du mésoderme et de l'endoderme définitif se délaminent. Trois molécules de signalisation, WNT3, BMP4 et NODAL, sont essentielles à la formation et à la structuration de la LP. Les interactions initiales entre ces voies de signalisation peuvent être résumées comme suit : Bmp4 -> Wnt3 -> Nodal -> Bmp4. Cependant, l'interdépendance entre ces facteurs, ainsi que leur rôle précoce au cours du développement, a rendu difficile la caractérisation de leurs contributions respectives à ce processus in vivo. Un système in vitro, nommé Gastruloïdes 2D de souris (Gas2D), permettant un meilleur contrôle des signaux auxquels les cellules pluripotentes sont exposées, nous permet maintenant d'aborder cette question. Nous avons d'abord étudié l'impact de ces trois facteurs sur l'organisation spatiale et les trajectoires de développement des Gas2D, en utilisant l'immunofluorescence, la RT-qPCR et l'analyse en composantes principales. Nous avons trouvé que lorsque BMP4 est présent, il domine NODAL/ACTIVIN et WNT3 et impose un caractère postérieur à la différenciation des colonies, alors qu'en son absence NODAL/ACTIVIN et WNT3 favorisent un caractère distal à la différenciation. Cependant, l'utilisation de deux lignées cellulaires mutantes pour Nodal nous a permis de montrer qu'avant l'action de BMP4 et WNT3, NODAL est nécessaire pour établir les lignages mésodermique et endodermique, et qu'une fois la LP formée, la signalisation NODAL reste importante pour leur spécification en endoderme ou en mésoderme. Nous présentons également l'annotation précise des types cellulaires générés dans les Gas2D stimulés par BMP4, tels que révélé par le séquençage de l'ARN en cellule unique, et la comparaison avec des jeux de données embryonnaires. La plupart des cellules passent par un état LP et subissent une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), se différenciant en mésoderme naissant, en mésoderme extra-embryonnaire ou en progéniteurs hémato-endothéliaux. Certaines cellules ne subissent pas de TEM et donnent naissance à de l'épiblaste indifférencié, de l'ectoderme de surface ou à des CGPs. Ensuite, en modulant la signalisation BMP, nous avons montré que la réduction de l'exposition au BMP4 exogène permet la formation de LP antérieure, tout en maintenant de la LP postérieure dans la région où la signalisation BMP reste active. De manière intéressante, en bloquant la signalisation BMP au cours de la différenciation, nos résultats suggèrent que l'exposition à la signalisation BMP au cours de la formation de la LP prépare les cellules à l'engagement mésodermique. Enfin, nous avons utilisé une lignée de cellules souches embryonnaires de souris, mutée pour SMAD4, effecteur commun aux voies de signalisations BMP et NODAL. Nous avons montré que SMAD4 est strictement nécessaire à la signalisation BMP pendant toute la durée de la différenciation des Gas2D, tandis que certaines cibles de NODAL restent partiellement actives et permettent la formation d'épiblaste caudal au lieu de LP antérieur dans les Gas2D stimulés par WNT3A. Dans l'ensemble, nos résultats définissent une approche efficace pour l'étude de la régionalisation de l'embryon in vitro et démontrent sa complémentarité avec les études embryologiques.

Gastrulation is the period in all amniote embryos when the pluripotent epiblast gives rise to the Primordial Germ Cells (PGCs) and to the three germ layers : the ectoderm, endoderm and mesoderm, from which all fetal tissues are derived. In the mouse embryo it begins at embryonic day 6.5 day with the formation of the primitive streak (PS) in the posterior epiblast, from which mesoderm and definitive endoderm cells delaminate. Three signalling molecules, WNT3, BMP4 and NODAL, are essential for the formation and the patterning of the PS. The initial interactions between those signalling pathways can be summarized as Bmp4 -> Wnt3 -> Nodal -> Bmp4. However, the interdependence between these factors, as well as their earlier role during development, has made it difficult to characterise their respective contributions to this process in vivo. An in vitro system, named mouse 2D gastruloids (m2Dgas), allowing better control of the signals to which pluripotent cells are exposed, now allows us to address this issue. We first studied the impact of these three factors on the spatial organization and the developmental trajectories of m2Dgas, using immunofluorescence, RT-qPCR, and principal component analysis. We found that when BMP4 is present it dominates NODAL/ACTIVIN and WNT3 and imposes a posterior character to the colonies differentiation, whereas in its absence NODAL/ACTIVIN and WNT3 promote a distal character to the differentiation. However, the use of two Nodal mutant cell lines allowed us to show that prior to BMP4 and WNT3 action, NODAL is required to establish the mesoderm and endoderm lineages, and that once the PS is formed, NODAL signalling remains important for their developmental progression toward mesoderm or endoderm. We also present the precise annotation of cell types generated in BMP4-stimulated m2Dgas, as revealed by single cell RNA sequencing, and comparison to embryonic datasets. Most cells go through a PS state and undergo epithelial'mesenchymal transition (EMT), differentiating into nascent mesoderm, extra-embryonic mesoderm or haematoendothetial progenitors. Some cells do not go through EMT and give rise to undifferentiated epiblast, surface ectoderm or PGCs. Then, by modulating BMP signalling, we showed that reducing exogenous BMP4 exposure enables the formation of anterior PS, while keeping posterior PS in the region where BMP signalling remains active. Interestingly, by abolishing BMP signalling in the course of the differentiation, our results suggest that the exposure to BMP signalling during PS formation primes the cells toward mesodermal commitment. Finally, we used a mouse embryonic stem cell line, knocked-out for Smad4, which encodes a common effector of BMP and NODAL signalling. We showed that SMAD4 is strictly required for BMP signalling during the whole course of m2Dgas differentiation, while some NODAL targets remain partially active and enables the formation of Caudal Lateral Epiblast instead of anterior PS in WNT3A-stimulated m2Dgas. Overall, our results delineate an efficient approach for the study of embryo patterning in vitro and demonstrate its complementarity to embryological studies.