Analyse taxonomique et fonctionnelle du microbiote digestif et des modifications de la barrière entérocytaire au cours de l'entérocolite du neutropénique

Taxonomic and functional analysis of the gut microbiota and enterocyte barrier modifications during neutropenic enterocolitis

• Auteur / Autrice : Natacha Kapandji
• Direction : Lara Zafrani, Muriel Thomas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie
• Date : Soutenance le 14/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomes, biologie cellulaire et thérapeutiques (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : François Barbier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Paul-Louis Woerther
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : François Barbier, Stéphanie Nguyen Quoc

Mots clés

Mots clés contrôlés

Entérocolite du patient neutropénique

Microflore

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Enterocolite du neutropénique

Leucémie aiguë myéloïde

Microbiote digestif

Barrière entérocytaire

Citrulline

I-Fabp

Métagenomique

Transcriptomique

Acides gras à chaines courtes

Neutropenic enterocolitis

Acute myeloid leukemia

Gut microbiota

Enterocyte barrier

Citrulline

I-Fabp

Metagenomic

Transcriptomic

Short-Chain-Fatty-Acids

Résumé

L'entérocolite du neutropénique (EN) est une complication sévère des chimiothérapies utilisées notamment dans la prise en charge des hémopathies malignes. Le diagnostic repose sur l'association : d'une neutropénie inférieure à 500×109 neutrophiles/L, d'une fièvre supérieure à 38,3°C, et d'un épaississement de la paroi intestinale. Ce travail s'intéresse à sa physiopathologie en se concentrant sur le rôle du microbiote digestif et son interaction avec la barrière entérocytaire. Pour cela, une cohorte de patients a été constituée avec l'Autorisation du Comité de Protection des Personnes Ile de France VII. Ils présentaient une leucémie aiguë myéloïde et un suivi longitudinal avec des prélèvements de selles et de sang réalisés avant la chimiothérapie, à J14 de neutropénie, à la sortie d'aplasie et en cas de diarrhée ou de diagnostic avéré d'EN. Entre Septembre 2020 et Août 2022 65 patients ont été inclus. Parmi eux 26 ont présenté une EN. Ils ont été comparés aux 39 autres patients de la cohorte et à 13 patients pris en charge pour une EN dans le cadre d'une autre hémopathie maligne. La première partie de ce travail s'est intéressée aux modifications du microbiote digestif évalué par métagénomique ciblée 16s. Nous avons observé une diminution de la densité bactérienne et des indexes d'alpha-diversité après la chimiothérapie sans pouvoir identifier de modifications spécifiques des EN comparées aux patients contrôles sans complication digestive à J14 d'aplasie ou à ceux présentant des diarrhées non compliquées. Cependant, l'analyse dynamique de la béta-diversité était en faveur d'une signature bactérienne des EN caractérisée par la surreprésentation des gènes Veillonella, Eggerthellaceae, Enterococcus et Barnesiella. L'analyse non supervisée a mis en évidence 4 Entérotypes avec une transition temporelle d'un entérotype riche et diversifié à l'état basal vers les 2 entérotypes statistiquement associés aux EN marqués par une faible densité bactérienne, une faible diversité, une prédominance d'Enterococcus et une déplétion en bactéries productrices d'acides gras à chaînes courtes (AGCC). Ceci concordait avec les résultats des dosages d'AGCC fécaux qui montraient une diminution de la production du propionate et du butyrate en post chimiothérapie. Cette diminution était plus sévère chez les patients présentant une EN sans différence significative. Le butyrate et le propionate étant impliqués dans la littérature dans le maintien de l'intégrité de la barrière entérocytaire, nous avons évalué la masse entérocytaire par le suivi de la citrulline plasmatique. Les dosages se sont avérés faibles en post-chimiothérapie, reflet d'une masse entérocytaire altérée. Ils étaient corrélés à la charge bactérienne et à la production de butyrate. Enfin, l'analyse du transcriptome sur les pièces de colectomies de 6 patients opérés pour EN sévère a mis en évidence une surreprésentation de la voie KEGG JAK-STAT. Celle-ci signe la mise en place d'une réponse inflammatoire locale avec des cytokines pro-inflammatoires (IL6, LIF, OSM) et leurs récepteurs (OSMR, IL7R), ainsi que des facteurs de croissance (G-CSF). Elle s'associait à la mise en place d'une réponse adaptative avec une augmentation de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1) partagée par la majorité des voies surexprimées chez nos patients. Ainsi, ce travail confirme l'impact majeur de la chimiothérapie sur le microbiote digestif et la barrière entérocytaire. L'analyse taxonomique du microbiote met en évidence un continuum dans la dysbiose entre les patients présentant des complications digestives moins sévères (diarrhée, mucite) et ceux présentant une EN. De plus l'EN est marquée par une diminution majeure de la masse entérocytaire pour laquelle le rôle propre de la diminution de production des AGCC reste à explorer. Enfin, dans ses formes sévères, elle est marquée par la mise en place d'une réaction inflammatoire locale malgré la neutropénie.

Neutropenic Enterocolitis (NE) is a severe complication of chemotherapy, particularly prevalent in hematological malignancies. Diagnosis is based on the association of neutropenia with lower than 500 109 cells/L, fever higher than 38.3°C, and thickening of the intestinal wall. This research focuses on the understanding of NE's pathophysiology, with a focus on the role of gut microbiota and its intricate interplay with the enterocyte barrier. To investigate this, a cohort was established with the approval of the Ethic Committee of the Ile de France region. Patients diagnosed with acute myeloid leukemia underwent repeated stool and blood sampling before chemotherapy, at Day 14 of neutropenia, upon leukocyte recovery, and in the event of uncomplicated diarrhea or NE. Between September 2020 and August 2022, 65 patients were enrolled. Among them, 26 developed NE while 39 served as controls. The 26 NE patients were compared both to the 39 controls and to 13 additional patients who were treated for NE and had a different underlying hematological malignancy. First, we focused on the alterations of the gut microbiota using targeted 16S metagenomic analysis. We observed a reduction in bacterial density, and decreased alpha-diversity indexes following chemotherapy. However, we were unable to identify specific modifications associated with NE when compared to controls with or without uncomplicated diarrhea. Nevertheless, the dynamic analysis of beta-diversity revealed a bacterial signature of NE characterized by the overrepresentation of genes related to Veillonella, Eggerthellaceae, Enterococcus, and Barnesiella. We also conducted un unsupervised analysis of the metagenomic data which unveiled the existence of four distinct enterotypes. There was a temporal transition from a rich and diverse enterotype at baseline to the two enterotypes that exhibited statistically significant associations with NE. These enterotypes were characterized by lower bacterial density, reduced diversity, a predominance of Enterococcus, and a depletion of short-chain-fatty-acids (SCFAs) producers. These findings were consistent with the results of fecal SCFA measurements, which indicated a decrease in the production of propionate and butyrate after chemotherapy. This reduction was more pronounced in patients with NE, although the difference did not reach statistical significance. As butyrate and propionate are well-documented in the literature for their role in maintaining the integrity of the enterocyte barrier, we assessed enterocyte mass by monitoring plasma citrulline levels. These measurements revealed significantly reduced levels after chemotherapy, indicating a severely compromised enterocyte mass. They were correlate to bacterial load, alpha-diversity, and butyrate production. Furthermore, the analysis of the transcriptome of 6 colonic samples obtained from patients who underwent colectomies for severe NE, revealed an up-regulation of the JAK-STAT signaling KEGG pathway. This pathway indicates an inflammatory response involving pro-inflammatory cytokines (IL6, LIF, OSM) and their receptors (OSMR, IL7R), as well as growth factors (G-CSF). This was accompanied by the development of an adaptive immune response, characterized by an up-regulation of major histocompatibility complex class II molecules (HLA-DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1), which were shared across most up-regulated pathways. In conclusion, this study underscores the substantial impact of chemotherapy on both the gut microbiota and the integrity of the enterocyte barrier. Taxonomic analysis of the gut microbiota reveals a continuum of dysbiosis between less severe digestive complications (diarrhea, mucositis) and NE. Additionally, NE is characterized by a significant reduction in enterocyte mass whose link with the decrease in SCFA production needs to be clarified. Finally, in its severe forms, NE is marked by the emergence of a local inflammatory response, even in the presence of neutropenia.