Intéraction entre l'hétérochromatine facultative et la réparation des cassures double brin de l'ADN

Interplay between facultative heterochromatin and the DNA double-strand break repair response

• Auteur / Autrice : Enrico Pobega
• Direction : Sophie Polo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Oncogenèse
• Date : Soutenance le 07/12/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Épigénétique et destin cellulaire (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Sandra Duharcourt
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Aniek Janssen, Evi Soutoglou
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel Wassef, Thomas Clouaire

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réparation

Hétérochromatine

Cassures double-brin de l'ADN

Mots clés libres

Cassures double brin de l'ADN

Réparation de l'ADN

H3K27me3

UTX

JMJD3

EZH2

Chromosome X inactif

Variants de l'histone H3

Micro-irradiation laser

DNA double-strand breaks

DNA repair

H3K27me3

UTX

JMJD3

EZH2

Inactive X chromosome

Histone H3 variants

Laser micro-irradiation

Résumé

Le stress génotoxique endommage non seulement la séquence d'ADN mais induit également des altérations de la chromatine. La manière dont l'information épigénétique est préservée durant ce processus reste à élucider. Cette question est d'une importance particulière dans les domaines d'hétérochromatine, dont le maintien est critique pour assurer l'inhibition transcriptionnelle, la détermination du destin cellulaire et la ségrégation des chromosomes. Ces domaines de chromatine hautement organisés constituent une barrière à la signalisation et à la réparation des dommages à l'ADN, et ils présentent des taux élevés de mutations dans les cancers. Il existe deux formes principales d'hétérochromatine, constitutive et facultative, caractérisées par des marques épigénétiques distinctes. Les cassures double-brin de l'ADN (DSBs) dans l'hétérochromatine constitutive péricentromérique provoquent une décondensation de la chromatine sans perte détectable des marques spécifiques de ces domaines. Ces résultats suggèrent que des mécanismes de maintien opèrent pour préserver ces marques pendant la réparation des DSBs. De plus, certaines études se sont concentrées sur la réparation des DSBs dans les domaines d'hétérochromatine constitutive et ont mis en évidence des conséquences importantes pour les voies de réparation des DSBs. En revanche, les voies de réparation de l'ADN qui opèrent dans l'hétérochromatine facultative et les altérations qui surviennent dans ce type de chromatine en réponse aux DSBs sont relativement peu caractérisées. Dans ce contexte, notre objectif est de (1) caractériser les voies de réparation des DSBs opérant dans l'hétérochromatine facultative et (2) d'évaluer les altérations potentielles des marques d'hétérochromatine facultative en réponse aux DSBs. Nous utilisons le chromosome X inactif (Xi) comme modèle d'hétérochromatine facultative, car il est facilement détectable dans les cellules femelles humaines RPE-1 et est maintenu de manière stable au cours des divisions cellulaires somatiques. En évaluant le recrutement au Xi de facteurs de réparation spécifiques appartenant à trois voies de réparation des DSBs, nous observons qu'ils sont efficacement recrutés après des dommages induits par laser dans le Xi, suggérant que ce domaine d'hétérochromatine n'est pas réfractaire à la réparation des DSBs. En parallèle, nous montrons que la plupart des marques d'hétérochromatine facultative dans le Xi, incluant des modifications et variants d'histones spécifiques, ainsi que des longs ARN non-codants, ne sont pas affectées par l'induction de DSBs avec l'agent radiomimétique Néocarzinostatine. Nous avons ensuite caractérisé plus en détails la dynamique et la régulation de la marque d'hétérochromatine facultative H3K27me3. Nous montrons par plusieurs approches orthogonales que malgré le recrutement de la méthyltransférase d'H3K27 EZH2 à la chromatine en réponse aux DSBs, la marque H3K27me3 reste inchangée, suggérant une possible implication des déméthylases de H3K27. Grâce à des tests de déméthylation in vitro, nous observons une activité préférentielle sur H3.1 pour les déméthylases de H3K27me3 UTX et JMJD3. Nous montrons que l'inhibition des deux déméthylases entraîne une augmentation plus élevée du marqueur de dommages à l'ADN 'H2AX après l'induction de DSBs, soulignant l'importance fonctionnelle de la déméthylation de H3.1K27me3 dans la réponse aux DSBs. Ces découvertes suggèrent de nouveaux mécanismes contrôlant la réparation de l'ADN et le maintien de l'intégrité du génome via une régulation histone variant-spécifique d'une marque d'hétérochromatine facultative. Dans l'ensemble, ces études mettent en lumière le maintien de l'hétérochromatine facultative en réponse aux dommages de l'ADN et ouvrent la voie à une caractérisation plus poussée des acteurs moléculaires impliqués.

Genotoxic stress not only damages the DNA sequence but also induces alterations in the chromatin fibre. How the epigenetic information is preserved during this process remains to be elucidated. This question is of particular relevance in heterochromatin domains, whose maintenance is crucial to allow proper transcriptional inhibition, cell fate determination and chromosome segregation. These highly ordered chromatin domains pose a barrier to signalling and repair of DNA damage and display high mutation rates in cancer. There are two main forms of heterochromatin: constitutive and facultative, characterised by distinct epigenetic marks. DNA double Strand Breaks (DSBs) in constitutive pericentromeric heterochromatin trigger chromatin decondensation with no detectable loss of heterochromatin-specific histone modifications. These findings suggest that maintenance mechanisms operate to preserve heterochromatin marks during DSB repair. Furthermore, some studies have focused on DSB repair in constitutive heterochromatin domains and have highlighted relevant DSB repair pathway consequences. In contrast, the DNA repair pathways that operate in facultative heterochromatin and the alterations that occur in this chromatin type in response to DSBs are relatively uncharacterised. In this context, we aim to (1) characterise DSB repair pathways operating in facultative heterochromatin and (2) assess potential DSB-responsive alterations of facultative heterochromatin marks. We use the inactive X chromosome (Xi) as a model of facultative heterochromatin, as it is easily detectable in female human RPE-1 cells and is stably maintained even across somatic cell divisions. By assessing the recruitment to the Xi of specific repair factors belonging to three DSB repair pathways, we observe that they are efficiently recruited after laser-induced damage in the Xi, suggesting that this heterochromatin background is not refractory to DSB repair. In parallel, we show that most facultative heterochromatin marks in the Xi, including specific histone modifications and variants and long non-coding RNAs, are unaffected by DSB induction with the radiomimetic agent Neocarzinostatin. We further characterise the dynamics and regulation of the facultative heterochromatin histone mark H3K27me3. We show that despite a recruitment of the H3K27 methyltransferase EZH2 to chromatin in response to DSBs, H3K27me3 remains unchanged, as shown through several orthogonal approaches, suggesting a possible involvement of H3K27 demethylases. By in vitro demethylase assays, we observe an H3.1-preferential activity of the H3K27me3 demethylases UTX and JMJD3. We show that inhibition of both demethylases leads to a higher increase of the DNA damage marker gammaH2A.X after DSB induction, highlighting the functional relevance of H3.1K27me3 demethylation in the DSB response. These findings hint at new mechanisms that regulate DNA repair and maintain genomic integrity through histone variant-specific regulation of a facultative heterochromatin histone mark. Collectively, these studies shed light on facultative heterochromatin maintenance in response to DNA damage and pave the way for further characterisation of the molecular players involved.