Identification des facteurs de l'hôte nécessaires à la corruption de la signalisation de la petite GTPase Rac1 par le Facteur Cytotoxique Nécrosant (CNF1) des Escherichia coli pathogènes par crible à haut débit

Identification of host factors required for corruption of Rac1 small GTPase signaling by the Cytotoxic Necrotizing Factor-1 (CNF1) from pathogenic Escherichia coli through a high-content screening approach

• Auteur / Autrice : Eléa Paillares
• Direction : Emmanuel Lemichez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 24/11/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Unité Toxines Bactériennes (2017-....)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Dussurget
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Caroline Demangel, Didier Hilaire
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Blangy, Corinne Albiges-Rizo

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine G rac1

Cytotoxines

Escherichia coli

Mots clés libres

Bactéries pathogènes

Escherichia coli

Toxines

CNF1

Mycolactone

Rho GTPases

Rac1

Translocon Sec61

Crible à haut contenu

Pathogenic bacteria

Escherichia coli

Toxins

CNF1

Mycolactone

Rho GTPase

Rac1

Sec61 translocon

High content screening

Résumé

Rac1 est une petite GTPase de la superfamille p21-Ras qui joue un rôle central dans les interactions hôte pathogènes. Le Facteur Nécrosant Cytotoxique 1 (CNF1) est une toxine de type AB produite par les souches d'E. coli pathogènes extra-intestinales (ExPEC). La toxine CNF1 pénètre dans les cellules de l'hôte par endocytose médiée par le récepteur Lu/BCAM et transloque dans le cytosol depuis des vésicules acides. CNF1 déamide de manière irréversible un résidu glutamine spécifique des Rho GTPases Rac1, RhoA et Cdc42 en un acide glutamique. Cette modification post-traductionnelle verrouille les protéines Rho sous une forme activée liée au GTP. La déamidation des protéines Rho par CNF1 confère aux ExPEC des capacités accrues d'invasion de l'épithélium intestinal et de colonisation de l'intestin. L'étude de la toxine CNF1 a mis en lumière une régulation cryptique de la stabilité de la forme activée de Rac1 liée au GTP par dégradation protéasomale médiée par l'ubiquitine, puis a permis de définir que cette régulation est sous le contrôle de la E3 ligase HACE1. Dans cette nouvelle étude, nous avons réalisé un criblage quantitatif de siARN couvrant le génome humain, conçu pour identifier les facteurs cellulaires nécessaires à l'endocytose de CNF1 et à la dégradation protéasomale en aval de Rac1. Cette méthode de criblage quantitatif permet de classer les siARN en fonction de l'étendue de la protection qu'ils confèrent contre la dégradation protéasomale de Rac1 qu'induit CNF1. Ce crible a conduit à l'identification d'un ensemble de siARN conférant une protection modérée, ainsi qu'une protection majeure conférée par le siARN ciblant la sous-unité Sec61A1 formant le canal du translocon Sec61. Le translocon Sec61 sert de plate-forme pour la fixation des ribosomes à la membrane du réticulum endoplasmique et de canal pour la synthèse des protéines membranaires et sécrétées. La déplétion de Sec61A1 médiée par siARN n'a pas d'effet sur le mécanisme d'action du CNF1 compte tenu de l'observation de la forme déamidée de la GTPase RhoA dans les cellules intoxiquées. Au contraire nous montrons que le ciblage de Sec61A1 par traitement siARN ou par traitement des cellules à la mycolactone bloque l'activation de Rac1 médiée par CNF1 et son association aux membranes. En complément, nous montrons que l'activité du translocon Sec61 est requise à l'activation de RhoA et Cdc42 dans les cellules intoxiquées par CNF1. De plus, l'inhibition du translocon Sec61 atténue l'activation de Rac1 dans des cellules en culture non intoxiquées par CNF1. Nous montrons aussi que le stress du réticulum induit par la tunicamycine inhibe Rac1. L'ensemble de ces résultats montrent l'importance de l'activité du translocon Sec61 en tant que nouveau régulateur des Rho GTPases ouvrant la voie à une meilleure compréhension des mécanismes bidirectionnels de régulation du cytosquelette d'actine et de maintien de l'homéostasie du réticulum endoplasmique. Par conséquent, ces travaux révèlent le lien qui existe entre la régulation des GTPases Rho et l'activité du translocon Sec61, qui est une cible majeure de la cytotoxicité induite par la mycolactone de Mycobacterium ulcerans.

Rac1 is a small GTPase of the p21-Ras superfamily that plays a central in host-pathogen interactions. The Cytotoxic Necrotizing Factor 1 (CNF1) is an AB-like toxin produced by strains of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). The CNF1 toxin enters host cells by Lu/BCAM receptor-mediated endocytosis and translocates into the cytosol from acidic compartments. CNF1 irreversibly deamidates a specific glutamine residue on the Rac1 small GTPase, as well as RhoA and Cdc42 proteins, into a glutamic acid. This post-translational modification locks Rho proteins in an activated GTP-bound form. Deamidation of Rho proteins by CNF1 confers to ExPEC enhanced capacities for invasion of the intestinal epithelium and colonization of the gastrointestinal tract. The study of CNF1 toxin unveiled a cryptic regulation of the stability of the activated GTP-bound Rac1 by ubiquitin-mediated proteasomal degradation, that is under the control of HACE1 E3 ubiquitin ligase. In this new study, we performed a quantitative whole-human genome siRNA screen designed to identify cellular factors required for CNF1 endocytosis and downstream Rac1 proteasomal degradation. This quantitative screening method enables us to classify siRNAs according to their level of protection they confer against CNF1-mediated proteasomal degradation of Rac1. The screen led to the identification of an array of siRNA conferring mild protection, as well as major protection achieved by siRNA targeting the Sec61A1 subunit of the Sec61 translocon. The Sec61 translocon acts both as a docking site for ribosomes on endoplasmic reticulum membrane and as a channel for the synthesis of membrane and secreted proteins. siRNA-mediated depletion of Sec61A1 had no impact on the mechanism of action of CNF,1 given the observation of the deamidated form of the RhoA GTPase in intoxicated cells. On the contrary, we show that targeting Sec61A1 by siRNA treatment or by treating cells with mycolactone blocks CNF1-mediated Rac1 activation and its association with membranes. In addition, we show that Sec61 translocon activity is required for RhoA and Cdc42 activation in CNF1-intoxicated cells. Moreover, Sec61 translocon inhibition also attenuates Rac1 activation in cultured cells not intoxicated by CNF1. We also show that tunicamycin-induced reticulum stress inhibits Rac1. Taken together, these results demonstrate the importance of Sec61 translocon activity as a novel regulator of Rho GTPases, paving the way for a better understanding of the bidirectional mechanisms involved in the regulation of the actin cytoskeleton and maintaining endoplasmic reticulum homeostasis. Consequently, this work reveals the link between the regulation of Rho GTPases and the activity of translocon Sec61, a major target of mycolactone-induced cytotoxicity in Mycobacterium ulcerans.