RMN Séquences d'impulsion à ultra-haute résolution entièrement personnalisées pour l'analyse de mélanges complexes

Fully tailored ultrahigh-resolution NMR pulse sequences for the analysis of complex mixtures

• Auteur / Autrice : Xi Chen
• Direction : Nicolas Giraud, Gildas Bertho
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique
• Date : Soutenance le 07/07/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques (Paris ; 1998-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Landrieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Savarin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bénédicte Elena-Herrmann, Laura Castanar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasma sanguin

Métabolites

Urine

Espace extracellulaire

Lymphome diffus à grandes cellules B

Métabolomique

Résonance magnétique nucléaire

Mots clés libres

RMN à ultra-haute résolution

RMN Pure Shift

Suppression de l'eau

Quantification

Métabolomique

Profilage métabolique

Dlbcl

Milieu extracellulaire

Urine

Plasma

Ultrahigh resolution NMR

Pure shift NMR

Water suppression

Quantification

Metabolomics

Metabolic profiling

DLBCL

Extracellular medium

Urine

Plasma

Résumé

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique analytique puissante utilisée pour étudier les métabolites sans destruction de l'échantillon. La résolution et la sensibilité sont deux facteurs essentiels pour la qualité des spectres RMN. La résolution en RMN 1H est limitée par la dispersion des déplacements chimiques des protons. La mise en oeuvre de techniques de découplage homonucléaire permet de simplifier les spectres 1H, en obtenant des singulets pour chaque signal proton dans les molécules analysées. L'objectif du projet de thèse était de développer des expériences RMN à ultra-haute résolution pour analyser et quantifier des mélanges biologiques complexes. Il se compose de deux sous-projets: i) l'étude du mécanisme d'action de drogues anti-métaboliques sur des lignées cellulaires de lymphome au moyen de méthodes Pure Shift. ii) la détermination de la concentration absolue des métabolites dans ces cellules cancéreuse au moyen d'une bibliothèque de spectres Pure Shift de référence. Le premier sous-projet s'est concentré sur l'analyse qualitative du lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) par la méthode pure shift PSYCHE. Le DLBCL est un cancer du sang du système immunitaire qui produit des lymphocytes B anormaux. Bien que le traitement du DLBCL permette de guérir plus de la moitié des patients, à ce jour, 40 % des patients sont réfractaires ou rechutent. La métabolomique offre la possibilité d'étudier le mécanisme de la maladie cancéreuse. Dans cette thèse, nous avons mis en oeuvre une nouvelle séquence d'impulsions RMN Pure Shift pour comprendre et interpréter le mécanisme d'action de la DLBCL sous l'effet de deux inhibiteurs métaboliques (Kidrolase et Metformine). Pour s'adapter à la phase aqueuse des échantillons du milieu extracellulaire de la DLBCL, nous avons mis en oeuvre avec succès une nouvelle séquence d'impulsions Pure Shift basée sur la méthode PSYCHE, qui incorpore un bloc pour la suppression du solvant. Comme espéré, la résolution des données obtenues s'est avérée meilleure que celle enregistrée à l'aide d'une approche standard, malgré une sensibilité plus faible. Les analyses statistiques effectuées sur les profils métaboliques obtenus nous ont permis de suivre avec succès l'action de deux médicaments antimétaboliques sur le développement de ces cellules cancéreuses. Notamment, nous avons pu montrer clairement que la Kidrolase joue un rôle majeur dans les voies métaboliques de cette lignée DLBCL. Au cours du deuxième sous-projet, nous avons déterminé la concentration absolue d'échantillons biologiques par RMN pure shift. La quantification précise des métabolites est très importante dans le domaine des sciences de la santé pour comprendre les voies métaboliques du système étudié. Or il convient de rappeler que la quantification ne peut pas être réalisée directement à partir de l'intégration des signaux de protons dans les spectres de déplacement pur pour des échantillons aussi complexes. Nous avons créé un protocole analytique robuste basé sur l'utilisation d'une bibliothèque de spectres de référence pour ajuster l'empreinte de chaque métabolite d'intérêt et déterminer sa concentration absolue. L'approche basée sur la séquence Pure Shift SAPPHIRE améliorée par un bloc pour la suppression des solvants a été validée sur une série de mélanges modèles, montrant une précision et une linéarité excellentes dans un temps total (quelques heures) qui est entièrement compatible avec les études métabolomiques. En outre, nous avons appliqué avec succès notre méthode pour déterminer les concentrations absolues de métabolites dans un milieu extracellulaire de DLBCL, dans l'urine et dans le plasma, ce qui améliore les protocoles métabolomiques rapportés à ce jour en fournissant une vision quantitative et hautement résolue des processus métaboliques en jeu.

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is a cost-effective and accurate analytical technique commonly used to explore metabolites without requiring extensive sample manipulation. Resolution and sensitivity are two essential factors for the quality of NMR spectra. The resolution of 1H NMR spectroscopy is limited due to the chemical shift range and scalar coupling of near protons. Ultrahigh-resolution NMR has recently attracted considerable attention in the field of complex sample analysis. Indeed, the implementation of broadband homonuclear decoupling techniques has allowed us to greatly simplify crowded 1H spectra, yielding singlets for almost every proton site from the analyzed molecules. The aim of the PhD project is to develop and optimize ultrahigh-resolution NMR pulse sequences to analyze and quantify complex biological mixtures. It consists of two sub-projects: i) investigating the mechanism of action in treated biological lymphoma cancer cell lines by pure shift qualitative analysis. ii) determining the absolute concentration of metabolites in the biological samples by creating a pure shift library. The first sub-project focused on the qualitative analysis of Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) by the pure shift PSYCHE method. DLBCL is a blood cancer of the immune system that produces abnormal B-cell lymphocytes. Although DLBCL treatment cures more than half of patients, to date 40% of patients will either be refractory or relapse and die. Metabolomics provides the possibility to study the mechanism of cancer disease. In this thesis, we have implemented a new NMR pulse sequence based on a pure shift to understand and interpret the mechanism of action of DLBCL under the two metabolic inhibitors (Kidrolase and Metformin). To deal with the aqueous phase of the DLBCL extracellular medium samples, we have successfully implemented a new pure shift pulse sequence based on the PSYCHE method, which incorporates a block for solvent suppression. As expected, the resolution of the resulting data was found to be better than that recorded using a standard approach, despite a lower sensitivity. The statistical analyses carried out on the resulting metabolic profiles allowed us to successfully monitor the action of two antimetabolic drugs on the development of these cancer cells. Notably, we could clearly show that Kidrolase plays a major role in the metabolic pathways of this DLBCL cell line. During the second sub-project, we aimed at determining the absolute concentration of biological samples by the pure shift method. Accurate quantification of metabolites by NMR is particularly important in the health sciences field for understanding the metabolic pathways of the investigated system. Nevertheless, it should be reminded here that quantification cannot be performed straightforwardly from the integration of proton signals in the pure shift spectra for such complex samples. We created a robust analytical protocol based on the use of a pure shift library of calibration reference spectra to fit the fingerprint of each metabolite of interest and determine its absolute concentration. The approach based on the SAPPHIRE pulse sequence enhanced with a block for solvent suppression has been validated through the results of a series of model mixtures, exhibiting excellent trueness and linearity in a total time (a few hours) that is fully compatible with metabolomics studies. Furthermore, we have successfully applied our method to determine the absolute metabolite concentrations in a DLBCL extracellular medium, urine and plasma which improves the metabolomic protocols reported to date by providing a quantitative and highly resolved vision of metabolic processes at play.