Une approche omique intégrative révèle des déterminants de virulence de Yersinia pestis et des candidats biomarqueurs de la peste

Integrative omics profiling reveals Yersinia pestis virulence determinants and host candidate biomarkers of plague

• Auteur / Autrice : Pierre Lê-Bury
• Direction : Olivier Dussurget
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 22/06/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Yersinia (2004-....)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Friederike Jönsson
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Francis Impens
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Petra Dersch, Christophe Junot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunité innée

Multi-omique

Marqueurs biologiques

MicroARN

Résistance aux maladies

Virulence (microbiologie)

Protéomique

Bactériémie

Peste

Yersinia pestis

Mots clés libres

Yersinia pestis

Peste

Bactériémie

Protéomique

Base de données multi-omiques

Facteurs de virulence

Stress membranaire

Immunité innée

MicroARNs

Biomarqueurs précoces

Yersinia pestis

Plague

Bacteremia

Proteomics

Multi-omics database

Virulence factors

Membrane stress

Innate immunity

MicroRNAs

Early biomarkers

Résumé

Yersinia pestis est le bacille hautement virulent responsable de la peste, une zoonose ré-émergente généralement transmise par les puces se nourrissant sur des mammifères bactériémiques. Les trois principales formes cliniques sont i) la peste bubonique, la forme la plus fréquente résultant de la piqûre par une puce infectée, ii) la peste pulmonaire transmise par voie aérienne entre individus et iii) la peste dite septicémique, la forme la plus foudroyante. Dans les trois formes, les bactéries atteignent la circulation sanguine et conduisent à la mort. Nous avons utilisé une approche intégrative de biologie des systèmes afin de découvrir les facteurs bactériens qui jouent un rôle critique dans la phase bactériémique de la peste, une étape nécessaire à sa transmission dans le réservoir animal et à la progression de la maladie chez l'homme. Nous avons tout d'abord mis au point les conditions de culture de Y. pestis dans le plasma humain afin de générer un atlas protéique. Nous avons implémenté et optimisé une nouvelle méthode d'extraction de protéine et validé son utilisation en environnement de sécurité de niveau 3. Une méthode originale d'extraction des protéines après croissance des bactéries dans le sang a ensuite été mise au point afin de compléter les données plasmatiques. Nous avons obtenu le protéome de Y. pestis le plus complet à ce jour, couvrant plus de 2500 protéines. Parmi celles-ci, 1500 ont été détectées dans des bactéries associées aux monocytes et polynucléaires neutrophiles. En parallèle, nous avons développé un site internet - Yersiniomics - afin d'analyser et visualiser ces données. Nous avons collecté les génomes complets ainsi que les expériences transcriptomiques et protéomiques publiées, représentant plus de 300 conditions biologiques in vitro et in vivo intégrées dans la base de données. Ce site unique permet d'accéder à la collection de données de l'espèce Yersinia la plus complète actuellement, grâce à un navigateur génomique interactif intégrant l'ensemble des expériences au niveau de chaque gène. Une visualisation des données de couverture de séquençage des ARNs ainsi que des heat maps représentant les données transcriptomiques et protéomiques ont été implémentés. Nous avons ensuite sélectionné 44 protéines dont l'expression était modulée lors de la croissance bactérienne dans le plasma humain et/ou présentant un profil intéressant en utilisant Yersiniomics, puis nous avons inactivé les gènes correspondants. L'étude des souches mutantes nous a permis d'identifier plusieurs protéines impliquées dans l'homéostasie du cuivre, une subtilase, une protéase et des lipoprotéines nécessaires à la croissance de Y. pestis dans le sang humain et/ou à la virulence chez la souris. Nous avons notamment démontré que la lipoprotéine SlyB joue un rôle critique pour la virulence dans les trois formes de peste et pour la croissance de Y. pestis dans le sérum et le sang. Un mutant de délétion slyB montre une sensibilité accrue aux composés de la réponse immunitaire innée, tels que le complément et les protéases et peptides anti-microbiens des polynucléaires neutrophiles, et montre une survie réduite dans des macrophages humains. Ces phénotypes pourraient dériver d'une augmentation de l'instabilité et de la perméabilité de la membrane externe, et d'un dérèglement du protéome de l'enveloppe bactérienne. Enfin, nous avons exploité nos modèles expérimentaux pour découvrir de nouveaux biomarqueurs de la peste. Nous souhaitons détecter les microARNs systémiques différentiellement exprimés, utilisables comme biomarqueurs pour le diagnostic précoce de la maladie. Nous avons criblé 179 microARNs à un stade précoce de la maladie dans un modèle de peste pulmonaire chez la souris et établi la preuve de concept de cette approche en identifiant cinq candidats prometteurs. Nous développons maintenant une approche de criblage non biaisé basée sur le séquençage des microARNs totaux appliquée aux différents stades de la maladie.

Yersinia pestis is the highly virulent etiological agent of plague, a reemergent zoonosis generally transmitted by fleas feeding on bacteremic mammals. The three clinical forms of the disease in humans are i) bubonic plague, the most frequent form resulting from the bite of an infected flea, ii) pneumonic plague, an airborne disease transmitted between individuals, and iii) septicemic plague, the most fulminant form. Bacteria reach the bloodstream in all three forms and spread to multiple organs ultimately leading to death. We used an integrative systems biology approach to investigate the poorly characterized bacteremic phase of plague, an essential stage for plague transmission in reservoirs and disease development in humans. First, we set up culture conditions of Y. pestis in human plasma to generate a protein atlas. We implemented and optimized a new acid-based protein extraction method and validated inactivation of bacteria in a biosafety level 3 environment. We further established an original protocol for proteome analysis of bacteria grown in whole blood to enrich data obtained in infected plasma. We detected more than 2,500 proteins, representing the most complete proteome of Y. pestis today. Interestingly, a pool of 1,500 proteins were detected in bacteria associated with blood monocytes and neutrophils. In parallel, we developed an interactive website called Yersiniomics to help visualize and analyze these data. We also gathered Yersinia genomic, transcriptomic and proteomic public data representing more than 300 in vitro and in vivo experiments, which were integrated into a unique database. Yersiniomics allows access to the most complete dataset collection of Yersinia species through an interactive genome browser displaying results of every experiment for each gene on Yersinia reference genomes. Visualization of RNA-Seq coverage and differential analysis heatmaps for transcriptomic- and proteomic-data were also implemented. We then selected 44 proteins of Y. pestis based on Yersiniomics data and their expression profile during bacterial growth in human plasma and inactivated their corresponding genes. Phenotypic study of the mutants led to identification of several proteins involved in copper homeostasis, as well as a subtilase, a protease and lipoproteins of unknown function that were required for Y. pestis optimal growth in human blood and/or full virulence in a murine model of septicemic plague. Notably, we demonstrated that the lipoprotein SlyB is critical for virulence in the three forms of plague in mice and for Y. pestis growth in human blood and serum. A Y. pestis slyB deletion mutant is characterized by an increased susceptibility to innate immunity components, such as complement, neutrophil proteases and antimicrobial peptides, as well as a reduced survival in human macrophages. These phenotypes possibly result from increased outer membrane instability and permeability and imbalance of the bacterial envelope proteome. Lastly, our experimental models were exploited to discover new biomarkers of Y. pestis infection. In a murine model of pneumonic plague, we aimed at detecting differentially expressed systemic microRNAs which could be used as early diagnostic biomarkers of the disease. We screened 179 microRNAs at an early stage of infection and could establish the proof of concept of this approach by identifying five promising candidates. We are now developing an unbiased screening approach based on microRNA sequencing applied at different stages of plague.