Implication de la voie de signalisation Hippo/YAP dans la résistance acquise au paclitaxel du cancer pulmonaire

Hippo/YAP pathway involvement in therapeutic resistance to paclitaxel in lung cancer

• Auteur / Autrice : Solenn Brosseau
• Direction : Gérard Zalcman
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Oncogenèse
• Date : Soutenance le 30/01/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité
• Jury : Président / Présidente : Etienne Giroux Leprieur
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Carole Planès, Arnaud Mailleux, Guénaëlle Levallet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Julien Mazières, Anne-Claire Toffart

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de signalisation YAP

Voie de signalisation Hippo

Résistance aux substances

Paclitaxel

traitement médicamenteux

Tumeurs du poumon

Paclitaxel

Chimiothérapie

Poumon -- Cancer

Mots clés libres

Cancer du poumon

Paclitaxel

Chimiothérapie

Hippo

YAP

Chimio-résistance

Inhibiteur

Séquençage ARN

Lignées cellulaires

Cancer sur puce

Lung cancer

YAP (yes-associated protein)

TEAD

Microfluidics

Chemo-resistance

Paclitaxel

Résumé

Contexte : Le cancer du poumon est le cancer le plus fréquent et aussi le plus mortel dans le monde. La protéine YAP (Yes-associated protein) est un oncogène activé par une cascade de phosphorylation de la voie Hippo. Il a été démontré que YAP est souvent régulée à la hausse ou localisée au niveau nucléaire dans les cancers humains agressifs. Ce travail étudie l'effet de nouveaux inhibiteurs de l'interaction YAP/TEAD conçus par Inventiva Pharma dans des cellules cancéreuses pulmonaires ou mésothéliales et en particulier leur effet sur la chimiosensibilité au paclitaxel. Méthodes : Nous avons étudié l'effet du composé CV2640, seul ou en combinaison, sur la localisation et l'activité de YAP en réalisant des tests d'immunofluorescence et luciférase dans plusieurs lignées cellulaires (A549, HCC827 pour les deux tests et PC-9, HCC4006, H2052 pour le test de la luciférase). L'effet thérapeutique anti-métastatique du CV2640 a été évalué dans un test de cicatrisation sur les lignées cellulaires A549 et H2052. Nous avons également analysé les profils transcriptomiques des lignées cellulaires A549 parentales et résistantes au paclitaxel par séquençage de l'ARN. Nous avons calculé la concentration inhibitrice médiane (IC50) du paclitaxel et du trametinib pour évaluer l'efficacité du CV2640 sur la lignée cellulaire A549. Enfin, nous avons utilisé un système de puce microfluidique 3D pour étudier l'effet d'une combinaison de CV et de paclitaxel sur la lignée cellulaire A549 et sur des cellules tumorales provenant d'une tumeur fraîche de cancer du poumon. Résultats : L'activité YAP est apparue significativement plus élevée dans nos lignées résistantes au paclitaxel (p<0,01 ; pour les lignées cellulaires A549 et HCC827 ; test de Student-t). Le composé CV2640 a entrainé une diminution de l'activité YAP sur nos lignées A549, PC9 et H2052 (p<0,1, test de Wilcoxon, n=5 pour H2052 et n=7 pour PC9 et A549), et une réduction du signal nucléaire de YAP dans nos cellules A549 et HCC827 (p<0,001, test de Student, n=3). Les tests de cicatrisation indiquent que le composé CV2640 a significativement altéré la motilité cellulaire dans les lignées A549 et H2052 (p<0,5 pour A549 et p<0,001 pour H2052, test t de Student, n=3). De plus, la combinaison du composé CV2640 avec d'autres médicaments utilisés dans la chimiothérapie standard, tels que le paclitaxel et le trametinib, améliore sa réponse cytotoxique in vitro : les IC50 du paclitaxel et du trametinib sont significativement plus faibles en présence du composé CV2640 dans les cellules A549 (respectivement p<0,05, n=4, Mann-Whitney et p<0,05, n=3, Student t-test). L'analyse transcriptomique différentielle des lignées cellulaires A549 parentales et résistantes au paclitaxel par séquençage de l'ARN révèle un transcriptome massivement dérégulé. De plus, de nombreux gènes cibles de YAP/TEAD sont significativement diminués dans nos cellules résistantes en présence du CV2640 (p<0,05, test t à deux échantillons de Welch). Enfin, l'utilisation du système microfluidique 3D '' organ on chip '' nous a permis de confirmer l'effet cytotoxique de la combinaison de 100nM de paclitaxel et 20mM de CV2640 sur nos cellules A549 résistantes par rapport à la condition contrôle A549 résistante avec 20nM de paclitaxel (p=0,02, n=3, 2way ANOVA). Cette combinaison semble aussi être également prometteuse sur des cellules cancéreuses provenant d'une tumeur fraîche (une seule tumeur - pas d'analyse statistique). Conclusions : Nous avons confirmé la corrélation entre YAP et la chimiorésistance au paclitaxel. En outre, le composé CV2640 semble avoir une synergie claire avec d'autres chimiothérapies et YAP pourrait donc être une cible prometteuse pour le traitement du cancer du poumon.

Background: Lung cancer is one of the most prevalent cancers worldwide and 85% of patients will ultimately die from metastasis. Yes-associated protein (YAP) is an oncogene activated by a phosphorylation cascade of the Hippo pathway. It has been showed that YAP is often upregulated or nuclear localized in aggressive human cancers besides and there are many evidences linking YAP activation to several steps of the metastatic cascade. This work investigates the effect of novel inhibitors of the YAP/TEAD interaction designed by Inventiva Pharma in lung or mesothelial cancer cells and in particular their effect on chemoreversibility to paclitaxel. Methods: We studied the effect of CV2640, alone or in combination, on YAP localization and activity using immunofluorescence and the luciferase reporter gene assay in several cell lines (A549, HCC827 for both assays and PC-9, HCC4006, H2052 for luciferase assay). The anti-metastatic therapeutic effect of CV was evaluated in a wound healing assay on A549 and H2052 cell lines. We also analyzed the transcriptomic profiles of the parental and paclitaxel-resistant A549 cell lines by RNA sequencing. The median inhibitory concentration (IC50) of paclitaxel and trametinib were calculated to evaluate the efficacy of CV2640 in the A549 cell line. Finally, we used a 3D microfluidic chip system to study the effect of a combination of CV and paclitaxel on the A549 cell line and on tumor cells from a fresh lung cancer tumor. Results: YAP activity appeared to be significantly higher in our paclitaxel-resistant lines (p<0,01; for A549 and HCC827 cell lines; Student-t test). CV2640 treatment of our A549, PC9 and H2052 lines induced a decrease in YAP activity (p<0,1, Wilcoxon test, n=5 for H2052 and n=7 for PC9 and A549), and a reduction in YAP signal in the nuclei of A549 and HCC827 (p<0,001, Student-t-test, n=3). Wound healing assays indicate that IV1612640 significantly impaired cell motility in the A549 and H2052 lines (p<0,5 for A549 and p<0,001 for H2052, Student t-test, n=3). Furthermore, the combination of the compound CV2640 with other drugs used in standard chemotherapy, such as paclitaxel and trametinib, improves its cytotoxic response in vitro: the IC50s of paclitaxel and trametinib are significantly lower in the presence of CV2640 compound in A549 cells (respectively p<0,05, n=4, Mann-Whitney and p<0,05, n=3, Student t-test). Differential transcriptomic analysis of parental and paclitaxel-resistant A549 cell lines by RNA sequencing reveals a massively deregulated transcriptome. Furthermore, many YAP/TEAD target genes are significantly decreased in our resistant cells in the presence of CV2640 (p<0,05, Welch two sample t-test). Finally, the use of the 3D ''organ on chip'' microfluidic system confirms the cytotoxic effect of the combination of 100nM paclitaxel and 20'm CV2640 on our resistant A549 cells compared to the control condition A549 resistant with 20nM paclitaxel (p=0,02, n=3, 2way ANOVA) and also on cancer cells from a fresh tumor (no statistical analysis). Conclusions: We confirmed the correlation between YAP and paclitaxel chemoresistance. Furthermore, the compound CV2640 appears to have clear synergy with other chemotherapies and YAP may therefore be a promising target for the treatment of lung cancer.