Exploration structurale de la maturation des ARN

Structural exploration of RNA maturation

• Auteur / Autrice : Vincent Meynier
• Direction : Carine Tisné
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 20/01/2023
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Expression génétique microbienne (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Maria Duca
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Herman Van Tilbeurgh
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Célia Plisson-Chastang, Marc Graille

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épissage (génétique)

Ribonucléases

Méthyltransférases

Méthylation

ARN

Mots clés libres

Méthylation de l'ARN

Méthyltransférase d'ARN

Processing de l'ARN

RNase P

RNase Z

Enzyme d'addition de CCA

RlmJ

Mettl16

Mrpp1/mrpp2/mrpp3

RNA methylation

RNA methyltransferase

RNA processing

RNase P

RNase Z

CCA-Adding enzyme

RlmJ

Mettl16

Mrpp1/mrpp2/mrpp3

Résumé

Les ARN sont le produit de la transcription et doivent le plus souvent subir des étapes de maturation comprenant le processing de leurs extrémités, l'addition de la séquence CCA en 3' et l'incorporation de diverses modifications chimiques des nucléosides. La méthylation est la modification la plus abondante dans les trois domaines de la vie. Les méthyltransférases d'ARN (MTases) catalysent le transfert d'un groupement méthyle vers leurs substrats ARN en utilisant le plus souvent le cofacteur S-adénosyl-L-méthionine (SAM) comme donneur de méthyle. Il existe peu de structures de MTases liées à l'ARN en raison des difficultés à cristalliser les complexes ARN/protéine, ce qui implique une compréhension limitée de la reconnaissance des ARN par les MTases et des mécanismes de réaction de méthylation. Cependant, de nombreuses structures de MTases liées à leur cofacteur SAM sont disponibles, ce qui permet de bien comprendre la reconnaissance protéine/cofacteur SAM. La synthèse chimique de conjugués d'ARN ouvre de nouvelles stratégies en biologie de l'ARN. Nous avons utilisé des conjugués cofacteur-substrat SAM-ARN afin d'étudier la reconnaissance de l'ARN par des enzymes responsables des modifications de l'adénosine, m6A et m1A. Dans une première partie, j'ai utilisé des conjugués d'ARN contenant un analogue du cofacteur SAM connecté à l'atome N6 d'une adénosine au sein de dinucléotides, d'un trinucléotide ou d'un ARN de 13 nucléotides. Ces composés ont été utilisés dans des essais de cristallisation avec RlmJ, une méthyltransférase bactérienne introduisant la modification m6A sur l'ARN ribosomique. J'ai résolu deux structures cristallines de complexes RlmJ/conjugué SAM-ARN qui m'ont permis de déchiffrer les déterminants de la reconnaissance spécifique du substrat ARN par RlmJ et le mécanisme de transfert de méthyle par RlmJ. Ces travaux montrent que les conjugués cofacteur-ARN sont des outils efficaces pour étudier le site actif des enzymes de modification des ARN. Dans une seconde partie, nous avons optimisé les conjugués synthétisés pour s'adapter à la séquence d'un des ARN substrat de METTL16, une MTase humaine introduisant des m6A sur l'ARN messager. Les conjugués SAM-ARN ont été testés dans le but de développer des inhibiteurs de METTL16. Nous avons identifié de nouvelles molécules pouvant servir d'échafaudage à la conception futur d'inhibiteur fort et spécifique de cette MTase. Dans la troisième et dernière partie de mes travaux de thèse, j'ai étudié la maturation des ARN de transfert (ARNt) mitochondriaux humains qui subissent des étapes séquentielles de processing par la RNase P sur leur extrêmité 5' (complexe MRPP1/MRPP22/MRPP3) et par la RNase Z (ELAC2) pour processer leur extrêmité 3'. Ces ARNt sont ensuite maturés par l'enzyme d'addition de la séquence 3'CCA (TRNT1) pour fournir des ARNt prêts pour l'aminoacylation. De plus, les purines en positon 9 de ces ARNt sont méthylés par la MTase TRMT10C (complexe MRPP1/2). De nombreuses maladies mitochondriales sont causées par des mutations sur ces enzymes de maturation. Nous avons résolu, par microscopie électronique, les structures de la RNase P, de la RNase Z et de TRNT1 en train de maturer un ARNt mitochondrial. Ces structures révèlent chaque étape de la maturation des ARNt mitochondriaux humains en éclairant les architectures détaillées des complexes responsables de la N1-méthylation de A9 et G9, du processing des ARNt mitochondriaux en 5' et 3' et de l'addition de la séquence CCA en 3'.

RNAs are the product of transcription and most often have to undergo maturation steps including processing of their extremities, addition of the 3'-CCA sequence and incorporation of various chemical modifications of the nucleosides. Methylation is the most abundant modification in all three domains of life. RNA methyltransferases (MTases) catalyze the transfer of a methyl group to their RNA substrates, most often using the cofactor S-adenosyl-L-methionine (SAM) as a methyl donor. Few structures of RNA-bound MTases exist due to the difficulties to crystallize RNA/protein complexes, which implies a limited understanding of RNA recognition by MTases and of the mechanisms of the methylation reaction. However, many structures of cofactor-bound MTases are available, which provides a good understanding of protein/SAM cofactor recognition. The chemical synthesis of RNA conjugates opens new strategies in RNA biology. We have used cofactor-substrate SAM-RNA conjugates to study RNA recognition by m6A and m1A modifying enzymes. In the first part, I used RNA conjugates containing a SAM cofactor analogue connected to the N6 atom of an adenosine within dinucleotides, a trinucleotide or a 13-nucleotide RNA. These compounds were used in crystallization assays with RlmJ, a bacterial methyltransferase that introduces the m6A modification to ribosomal RNA. I solved two crystal structures of RlmJ/SAM-RNA conjugate complexes that allowed me to decipher the determinants of specific RNA substrate recognition by RlmJ and the mechanism of methyl transfer by RlmJ. This work shows that cofactor-RNA conjugates are efficient tools to study the active site of RNA modification enzymes. In a second part, we optimized the synthesized conjugates to fit the sequence of one of the RNA substrates of METTL16, a human MTase that introduces m6A onto messenger RNA. The SAM-RNA conjugates were tested with the aim of developing inhibitors of METTL16. We have identified new molecules that can serve as scaffolds for the future design of potent and specific inhibitors of this MTase. In the third and last part of my thesis, I studied the maturation of human mitochondrial transfer RNAs (tRNAs) which undergo sequential processing steps by RNase P for their 5'-end (MRPP1/MRPP22/MRPP3 complex) and by RNase Z (ELAC2) to process their 3'-end. These tRNAs are then matured by the 3'CCA-adding enzyme (TRNT1) to provide tRNAs ready for aminoacylation. In addition, the purines at position 9 of these tRNAs are methylated by the MTase TRMT10C (MRPP1/MRPP2 complex). Many mitochondrial diseases are caused by mutations in these maturation enzymes. We have resolved the structures of RNase P, RNase Z and TRNT1 maturing mitochondrial tRNA by cryo-electron microscopy. These structures reveal each step of human mitochondrial tRNA maturation by illuminating the detailed architectures of the complexes responsible for N1-methylation of A9 and G9, 5'- and 3'-processing, and 3'-addition of the CCA sequence of mitochondrial tRNAs.