La réplication de l'ADN chez les parasites du paludisme

Understanding DNA replication of Plasmodium falciparum

• Auteur / Autrice : Casilda Muñoz Castellano
• Direction : Ana Rita Gomes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 03/10/2023
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratory of Pathogens and Host Immunity (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Mathieu Brochet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Poli, Pei-Yun Jenny Wu
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Elena Gomez-Diaz, Benoit Miotto

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chromatine

Plasmodium falciparum

Biologie informatique

Génomique

Protéomique

Chromatine

Plasmodium falciparum

Bioinformatique

Protéomique

Génomique

Mots clés libres

Génomique

Protéomique

Bioinformatique

Origines de réplication

Chromatine

Plasmodium falciparum

Genomics

Proteomics

Bioinformatics

Origins of replication

Chromatin state

Plasmodium falciparum

Résumé

Le parasite Plasmodium falciparum, l’agent responsable du paludisme, a un cycle de vie complexe et emploie des stratégies de multiplication atypiques, adaptées à l'expansion rapide de la population pendant la colonisation de l'hôte et la transmission, qui ne sont pas entièrement comprises. Afin de comprendre l'initiation de la réplication de l'ADN de ce pathogène humain, mon projet s'est concentré sur deux aspects principaux de ce processus : l'identification et la caractérisation des origines de la réplication et de la machinerie de réplication.Dans la première partie de ce projet, j'ai combiné trois approches différentes pour cartographier les origines de réplication chez P. falciparum : ChIP-seq, le séquençage des brins naissants d'ADN (SNS-Seq) et la méthode NanoForkSpeed (NFS). J'ai d'abord réalisé les expériences ChIP-seq sur deux sous-unités du complexe de reconnaissance des origines de réplication (PfORC1 et PfORC2) au début de la schizogonie afin d'obtenir une cartographie de tous les sites d'initiation potentiels. Ensuite, j'ai identifié les sites de réplication actifs en utilisant deux stratégies : SNS-seq et la cartographie de l'incorporation de l'analogue de la thymidine BrdU dans l'ADN en réplication, en utilisant le séquençage nanopore et l'algorithme NFS. En combinant les données issues de ces différentes méthodes, j'ai obtenu un ensemble robuste d'origines de réplication qui présentent des caractéristiques similaires à celles des origines des mammifères, comme la distribution non aléatoire dans des zones d'initiation ou ‘clusters’ et l'association avec des séquences formant des G-quadruplex. Les origines de réplication montrent également des caractéristiques uniques. Elles sont associées à des gènes fortement transcrits, mais dépourvus de sites de début de transcription (TSS). En outre, les résultats montrent que la vitesse de la fourche de réplication est uniforme sur l'ensemble du génome, à l’exception d’une diminution significative au niveau des centromères et des télomères. Des informations obtenues sur molécules uniques, utilisant des lectures contenant de multiples événements d'initiation qui n'auraient pu provenir que de cellules individuelles, ont révélé une relation entre la vitesse à laquelle les fourches de réplication se déplacent et la distance par rapport à l'origine la plus proche. Cette approche à multiples facettes a fourni la première analyse complète du paysage génétique des origines de réplication chez P. falciparum.La deuxième partie de mon projet s'est concentrée sur la caractérisation du complexe réplicatif de P. falciparum en isolant des protéines sur l'ADN naissant, qui font potentiellement partie de la machinerie du réplisome. Dans l'ensemble, ce travail contribue aux études en plein essor, sur la réplication de l’ADN des parasites Plasmodium falciparum, dans l'hôte humain, et fournira une base solide pour les futures recherches dans ce domaine.

Plasmodium falciparum parasites have a complex life cycle and employ atypical multiplication strategies, tailored for fast population expansion during host colonisation and transmission, that are not fully understood. In an effort to unravel the initiation of DNA replication of these human pathogens my project focused on two main aspects of this process: (i) identifying and characterising the origins of replication and (ii) identifying and characterising the replication machinery.Regarding the first part, I combined three different approaches to map the origins of replication in P. falciparum. These were ChIP-seq, SNS-Seq and NFS. I first performed ChIP-seq on two subunits of the origin recognition complex (of PfORC1 and PfORC2) at the beginning of schizogony to obtain a cartography of all potential replication initiation sites. Next, I mapped sites of active replication using two strategies: sequencing DNA nascent strands (SNS-seq); and mapping the incorporation of the thymidine analogue BrdU into replicating DNA, using nanopore sequencing combined with NanoForkSpeed (NFS). By combining data from these different methods, I have obtained a robust set of origins of replication that display some characteristics similar to those of mammalian origins, such as the non-random distribution in initiation zones or clusters and the association with G-quadruplex forming sequences. Strikingly, they also display unique characteristics, since they are associated with highly transcribed genes but depleted from transcription start sites (TSS). Additionally, the results showed a uniform fork speed across the genome with a significant decrease in centromeres and telomeres. Single molecule information, using reads containing multiple initiation events which could have only come from individual cells, revealed a relationship between the pace at which replication forks travel and the distance to the nearest origin. This multifaceted approach provided the first comprehensive analysis of the genetic landscape of the origins of replication in P. falciparum.The second part of my project focused on the characterization of the replicative complex of P. falciparum by isolating proteins bound to nascent DNA at active replication forks.Overall, this work contributes to the growing field of studying how Plasmodium falciparum parasites replicate their genome within the human host, and I am confident that it will serve as a solid foundation for further investigations.