Exploration du rôle du récepteur purinergique P2RY1 dans le risque et la physiopathologie du diabète de type 2 : perspectives de la génomique fonctionnelle humaine

Exploring the Role of Purinergic Receptor P2RY1 in Type 2 Diabetes Risk and Pathophysiology : Insights from Human Functional Genomics

• Auteur / Autrice : Arnaud Dance
• Direction : Amélie Bonnefond
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 13/12/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomique intégrative et modélisation des maladies métaboliques (Lille) - Metabolic functional (epi)genomics and molecular mechanisms involved in type 2 diabetes and related diseases - UMR 8199 - UMR 1283
• Jury : Président / Présidente : Jérôme Eeckhoute
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amélie Bonnefond, Julie Dam
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hervé Le Stunff, Bertrand Blondeau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse de séquence d'ARN

Analyse de séquence d'ADN

Étude comparative

Sécrétion d'insuline

Purines

Agonistes des récepteurs purinergiques P2Y

génétique

Diabète de type 2

Séquençage des acides nucléiques

Études comparatives

Sécrétion

Insuline

Purines

Agonistes

Récepteurs purinergiques

Génétique

Diabète non-insulinodépendant

Mots clés libres

Diabète

Génétique

Purine

RCPG

Sécrétion

Insuline

Diabetes

Genetic

Purine

GPCR

Insulin

Secretion

Résumé

Les études d'association à l'échelle du génome (GWAS) ont montré que le locus P2RY1 est associé au risque de diabète de type 2 (DT2) et aux traits glycémiques associés. P2RY1 est un récepteur couplé à une protéine G (GPCR) activé par l'ATP et l'ADP, qui est fortement exprimé dans les îlots pancréatiques, en particulier dans les cellules bêta, où l'ATP/ADP stimule la sécrétion d'insuline en activant les canaux potassiques dépendants de l'ATP. À travers la génétique fonctionnelle, nous avons cherché à analyser les contributions potentielles des variants génétiques de P2RY1 au risque de DT2 et à d'autres caractéristiques métaboliques. Nous avons ensuite caractérisé les voies de signalisation en aval de P2RY1 dans les cellules bêta pancréatiques humaines et déchiffré son rôle potentiel dans la sécrétion d'insuline.P2YR1 a été séquencé chez 9,266 adultes, y compris des cas de DT2 et des témoins à glycémie normale. Pour évaluer l'effet fonctionnel de chaque variant identifié, nous avons réalisé 1) des expériences de luciférase (système NFAT-RE) sur des cellules HEK293 surexprimant chaque variant, suivis de l'activation de P2YR1 par des doses croissantes de MRS2365 (méthanocarba-2MeSADP), qui est un agoniste spécifique de P2RY1, et 2) une immunofluorescence pour évaluer la localisation cellulaire et l'expression de chaque mutant. Nous avons également effectué une analyse de locus de caractères quantitatifs (eQTL) chez 103 donneurs, basée sur la séquence d'ARN dans les îlots pancréatiques et le génotypage par microaray d'ADN. Dans les cellules bêta pancréatiques humaines (EndoCBH5), nous avons réalisé des expériences de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) couplés à l'activation de P2YR1 par MRS2365 ou son inhibition par MRS2500.Nous avons identifié 22 variants faux-sens rares dans P2RY1 (dont 10 nouveaux variants). Nos analyses in vitro ont mis en évidence 7 mutations de perte de fonction. 87 % des porteurs de mutations présentaient un DT2. Les analyses eQTL ont montré qu'un groupe de polymorphismes nucléotidiques (SNP ; n=63) situé dans une région enhencer était significativement associé à une augmentation de l'expression de P2RY1 dans les îlots et à une diminution du risque de DT2, tandis qu'un autre groupe de SNP (n=51) était significativement associé à une diminution de l'expression de P2RY1 dans les îlots humains et à une augmentation du risque de DT2. Dans des cellules bêta Humaine (EndoCBH5), des experiences de secretion d'insuline (GSIS) ont montré que l'agoniste spécifique de P2RY1, MRS2365, entraînait une augmentation de 40 % de la sécrétion d'insuline lorsque les cellules était stimulé par 20 mM de glucose. Alors que l'inhibition de P2RY1 entraînait une diminution de 25% de la sécrétion d'insuline. Une analyse transcriptomique (par séquençage d'ARN) de la voie P2RY1 dans les cellules EndoCBH5 en réponse à l'agoniste MRS2365 ont démontrées que l'activation de P2RY1 entraînait une diminution de l'expression de TXNIP.Nos études génétiques, génomiques fonctionnelles et pharmacologiques suggèrent que la dysfonction de P2RY1 est causalement associée au risque de DT2 et que P2RY1 contribue à l'activation de la voie de sécrétion d'insuline. Des agonistes spécifiques et puissants de P2RY1 qui ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique sont disponibles et pourraient être testés en tant que nouvelle classe potentielle d'insulinosécréteurs.

Genome-wide association studies (GWAS) have shown that the P2RY1 locus is associated with type 2 diabetes (T2D) risk and with glucose levels. P2RY1 is a G-protein coupled receptor (GPCR) activated by ATP and ADP, which is highly expressed in pancreatic islets, particularly in β cells where, ATP/ADP stimulate insulin secretion by activating the ATP-dependent potassium channels. Through functional genetics, we aimed to analyze the putative contributions of genetic variants of P2RY1 to T2D risk and to other metabolic traits. We then characterized the downstream signaling pathways of P2RY1 in human pancreatic beta cells and deciphered its putative role in insulin secretion.P2YR1 was sequenced in 9,266 adults including cases with T2D and normal glucose controls. To assess the functional effect of each identified variant, we performed 1) luciferase assays (NFAT-RE system) on HEK293 cells overexpressing each variant, followed by P2YR1 activation by increasing doses of MRS2365 (methanocarba-2MeSADP) that is a specific agonist of P2RY1, and 2) immunofluorescence to assess cellular localization and expression of each mutant. We also performed expression quantitative trait loci (eQTL) analysis in 103 donors based on RNA-seq of pancreatic islets and DNA microrrays genotyping. In human pancreatic β cells (EndoCBH5), we performed glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assays coupled to P2YR1 activation by MRS2365 or inhibition by MRS2500.We identified 22 rare missense variants in P2RY1 (including 10 novel variants). Our in vitro analyses highlighted 7 loss-of-function mutations. 87% of the mutation carriers presented with T2D. Expression QTL analyses showed that a block of single nucleotide polymorphisms (SNPs; n=63) located in an enhancer of human islets was significantly associated with increased islet expression of P2RY1 and decreased T2D risk while another block of SNPs (n=51) was significantly associated with decreased expression of P2RY1 in human islets and increased T2D risk. In EndoCBH5, the GSIS assay showed that the P2RY1 specific agonist MRS2365 led to a 30% increase of insulin secretion when stimulated with 20mM of glucose. A kinome analysis (through PAMGENE technology) and transcriptomic analysis (through RNA sequencing) of the P2RY1 pathway in the EndoCBH5 cells in response to MRS2365 agonist orevealed that the activation of P2RY1 led to a decrease in the expression of TXNIP.Our genetic, functional genomic and pharamacological studies suggest that P2RY1 dysfunction is causatively associated with T2D riskand that P2RY1 contributes to the activation of the insulin secretion pathway. P2RY1 potent and selective agonists that cannot cross the blood-brain barrier are available, and could be tested as a potential new class of insulin secretagogues.