Étude de la maturation protéolytique et du trafic intracellulaire de la protéine de capside ORF2 du virus de l'hépatite E (HEV)

Study of the proteolytic maturation and intracellular trafficking mechanisms of the hepatitis E virus ORF2 capsid protein

• Auteur / Autrice : Martin Ferrié
• Direction : Laurence Cocquerel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie fondamentale
• Date : Soutenance le 10/11/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Center for Infection and Immunity of Lille
• Jury : Président / Présidente : Réjane Paumelle-Lestrelin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philip Meuleman, François Foulquier
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emmanuelle Blanchard-Laumonnier, Nicole Pavio

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transporteurs nucléocytoplasmiques

Maturation post-traductionnelle des protéines

Peptide hydrolases

Capside

Virus de l'hépatite E

Adressage des protéines

Protéases

Protéines virales

Infections à hépatovirus

Virus de l'hépatite E

Mots clés libres

Virus de l'hépatite E

Protéine ORF2

Trafic nucléocytoplasmique

Usines virales

Complexe adapteur AP-1

Maturation protéolytique

Furine

Préséniline

Hepatitis E Virus

ORF2 protein

Nucleocytoplasmic shuttling

Viral factories

AP-1 adaptor complex

Proteolytic maturation

Furin

Presenilin

Résumé

L'infection par le virus de l'Hépatite E (HEV) est un problème majeur de santé publique qui toucherait 100 millions de personnes et tuerait 100 000 personnes chaque année dans le monde. Le HEV est la première cause d'hépatite aigüe dans le monde. En France, la séroprévalence s'élève à 22,4%. Ce virus se transmet par voie féco-orale ou par la consommation de viande contaminée mal cuite. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé plus particulièrement à la protéine de capside ORF2, qui est l'unité structurale des particules virales et un acteur central du cycle infectieux du HEV. La protéine ORF2 est une protéine de 660 acides aminés qui possède un peptide signal N-terminal et trois sites potentiels de N-glycosylation. Au cours de son cycle infectieux, le HEV produit au moins trois formes de sa protéine de capside : (i) la forme ORF2g (pour glycosylée) et (ii) la forme ORF2c (pour clivée), abréviées ORF2g/c, qui sont des formes glycosylées et massivement sécrétées dans les surnageants de culture ou le sérum des patients infectés, et (iii) la forme ORF2i (pour infectieuse), qui n'est pas glycosylée et qui est associée aux particules virales.Dans le cadre de mes travaux de thèse, j'ai étudié les mécanismes de maturation protéolytique et de trafic intracellulaire de la protéine ORF2. Plus précisément, j'ai d'abord montré que la protéine ORF2 était importée dans le noyau des cellules infectées par le biais d'un mécanisme dépendant de l'Importine-alpha1, ceci grâce à un motif riche en résidus arginine situé à l'extrémité N-terminale de l'ORF2 et nommé ARM. La protéine ORF2 est ensuite exportée vers le cytoplasme par un mécanisme dépendant de l'exportine CRM1, ceci grâce à trois sites d'export nucléaire (NES9, NES10 et NES12) que nous avons identifiés dans la séquence de l'ORF2. J'ai également montré que le trafic nucléo-cytoplasmique de l'ORF2 régule probablement l'expression de certains gènes de l'immunité antivirale aux temps précoces de l'infection.Dans un second temps, j'ai participé à l'identification et à la caractérisation des usines virales du HEV. En ce sens, nous avons montré que les protéine virales ORF1, ORF2 et ORF3, ainsi que l'ARN viral sont enrichis dans des structures vésiculaires et tubulaires localisées dans les régions périnucléaires des cellules infectées. Nous avons montré que ces structures sont également enrichies en marqueurs du compartiment endosomal de recyclage (ERC), comme Rab11 et CD71, indiquant que les usines virales du HEV dérivent probablement de l'ERC. En réalisant des expériences d'extinction de Rab11 avec des ARN interférents, nous avons confirmé l'importance de l'ERC dans la production des particules virales du HEV.Dans un troisième temps, j'ai démontré que la protéine ORF2i, qui est associée aux membranes de la voie de sécrétion, est adressée aux usines virales par un mécanisme faisant intervenir le complexe adapteur AP-1.Dans un quatrième temps, j'ai caractérisé les mécanismes de maturation protéolytique des formes ORF2g/c et ORF2i. J'ai montré que la furine, une proproprotéine convertase de la voie de sécrétion, est impliquée dans la maturation protéolytique des glycoprotéines ORF2g/c. J'ai également montré que la préséniline, qui est la sous-unité catalytique du macro-complexe Gamma-sécrétase, est impliquée dans la maturation protéolytique de la forme infectieuse ORF2i. De manière intéressante, j'ai montré que l'inhibition pharmacologique de la préséniline réduit drastiquement l'infectiosité virale dans des lignées d'hépatocarcinome humain et dans des hépatocytes primaires humains. Ces données suggèrent que l'inhibition pharmacologique de la préséniline représente une stratégie antivirale prometteuse.En conclusion, les résultats obtenus dans le cadre de ma thèse permettent de mieux comprendre les mécanismes d'adressage subcellulaire et de maturation protéolytique de la protéine de capside ORF2, et ouvrent la voie au développement de nouvelles thérapies pour lutter contre le HEV.

Hepatitis E virus (HEV) infection is a major public health problem, affecting an estimated 100 million people and killing 100,000 every year worldwide. HEV is the leading cause of acute hepatitis worldwide. In France, seroprevalence is 22.4%. This virus is transmitted via the feco-oral route, or by eating contaminated undercooked meat. During my thesis, I focused on the ORF2 capsid protein, which is the structural unit of viral particles and a central player in the HEV lifecycle. ORF2 is a 660 amino acid protein with an N-terminal signal peptide and three potential N-glycosylation sites. During its lifecycle, HEV produces at least three forms of its capsid protein: (i) the ORF2g (for glycosylated) form and (ii) the ORF2c (for cleaved) form, abbreviated ORF2g/c, which are glycosylated forms and massively secreted in culture supernatants or serum from infected patients, and (iii) the ORF2i (for infectious) form, which is not glycosylated and is associated with viral particles.As part of my thesis work, I studied the mechanisms of proteolytic maturation and intracellular trafficking of the ORF2 protein. More specifically, I first showed that ORF2 is imported into the nucleus of infected cells via an Importin-alpha1-dependent mechanism, thanks to an arginine-rich motif located at the N-terminus of ORF2 and named ARM. The ORF2 protein is then exported to the cytoplasm via a CRM1 exportin-dependent mechanism, thanks to three nuclear export sites (NES9, NES10 and NES12) that we have identified in the ORF2 sequence. I have also shown that nucleocytoplasmic trafficking of ORF2 probably regulates the expression of certain antiviral immunity genes in the early stages of infection.Secondly, I participated in the identification and characterization of HEV viral factories. We have shown that the viral proteins ORF1, ORF2 and ORF3, as well as viral RNA, are enriched in vesicular and tubular structures located in the perinuclear regions of infected cells. We have shown that these structures are also enriched in markers of the endosomal recycling compartment (ERC), such as Rab11 and CD71, indicating that HEV viral factories probably derive from the ERC. By performing Rab11 silencing experiments with siRNAs, we confirmed the importance of the ERC in the production of HEV viral particles. Thirdly, I demonstrated that the ORF2i protein, which is associated with the membranes of the secretion pathway, is addressed to viral factories by a mechanism involving the AP-1 adaptor complex.In a fourth step, I characterized the proteolytic maturation mechanisms of the ORF2g/c and ORF2i forms. I showed that furin, a proproprotein convertase of the secretory pathway, is involved in the proteolytic maturation of ORF2g/c glycoproteins. I have also shown that presenilin, which is the catalytic subunit of the macro-complex Gamma-secretase, is involved in the proteolytic maturation of the ORF2i form. Interestingly, I have shown that pharmacological inhibition of presenilin drastically reduces viral infectivity in human hepatocarcinoma lines and in primary human hepatocytes. These data suggest that pharmacological inhibition of presenilin represents a promising antiviral strategy. In conclusion, the results obtained during my thesis provide a better understanding of the mechanisms of subcellular addressing and proteolytic maturation of the ORF2 capsid protein, and pave the way for the development of new therapies to combat HEV.