Étude de l'interaction entre les peroxysomes et le virus de l'hépatite C

Study of the interaction between peroxysomes and hepatitis C virus

• Auteur / Autrice : Esther Martin de Fourchambault
• Direction : Yves Rouille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance le 03/11/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Center for Infection and Immunity of Lille - Centre d’Infection et d’Immunité de Lille
• Jury : Président / Présidente : François Helle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Birke Bartosch
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Joachim Lupberger, Annette Martin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Stress oxydatif

Péroxysomes

Interactions hôte-pathogène

Hepacivirus

Hépatite C

Stress oxydatif

Peroxysomes

Interactions hôte-agent pathogène

Virus de l'hépatite C

Hépatite C

Mots clés libres

Interaction hôte-Virus

Virus de l'hépatite C

Peroxysomes

Espèces réactives de l'oxygène

Stress oxydatif

Host-Virus interaction

Hepatitis C virus

Peroxisome

Reactive oxygen species

Stress oxyatif

Résumé

L'hépatite C est une maladie chronique occasionnant une atteinte hépatique évolutive pouvant conduire en 20 ou 30 ans à l'apparition d'une cirrhose ou d'un hépatocarcinome. L'agent pathogène responsable de cette maladie est le virus de l'hépatite C (HCV). C'est un petit virus enveloppé à ARN monocaténaire de polarité positive qui infecte les hépatocytes humains et se transmet exclusivement par contact sanguin. HCV induit un stress oxydatif et détourne le métabolisme des cellules-hôtes, en particulier le métabolisme des lipides. Pour ce faire, il altère la morphologie et le fonctionnement de nombreuses organelles comme le réticulum endoplasmique, les gouttelettes lipidiques et les mitochondries. Des études récentes suggèrent que les peroxysomes sont également impactés par l'infection par HCV. Les peroxysomes sont de petites organelles sphériques, dynamiques et multifonctionnelles dont le nombre, la taille et la fonction s'adaptent au contexte cellulaire. Ils sont notamment impliqués dans le métabolisme des lipides, le maintien de l'équilibre redox de la cellule et l'immunité innée antivirale. A ce titre, les peroxysomes sont la cible de nombreux virus. Lors d'un crible visant à découvrir de nouveaux partenaires cellulaires des complexes de réplication d'HCV, nous avons identifié la protéine ACBD5, une protéine de la membrane des peroxysomes. Des expériences d'immunomarquage ont permis d'observer dans une sous-population de cellules Huh-7 infectées un recrutement partiel d'ACBD5 et d'autres marqueurs peroxysomaux à proximité des complexes de réplication virale. Par ailleurs, indépendamment de leur recrutement, la morphologie des peroxysomes apparaît modifiée dans 20 à 30% des cellules infectées, selon la souche considérée. En effet, à 16 jours post-infection dans cette sous-population de cellules, le volume moyen des peroxysomes est multiplié par 2,3 tandis que le nombre de peroxysomes est divisé par 2,8. Nous nous sommes ensuite intéressés au rôle des peroxysomes dans le cycle viral. Pour ce faire, nous avons généré par CRISPR-Cas9 des cellules Huh-7 dépourvues de peroxysomes en inactivant le gène PEX3, ainsi que des cellules démunies de peroxysomes fonctionnels en inactivant le gène PEX5. Ces cellules KO ont été infectées avec les souches JFH1 et DBN3a d'HCV. Les particules virales infectieuses sécrétées dans le surnageant des cellules infectées ont été titrées et n'ont révélé aucun impact des KO sur la production de nouveaux virions. Les peroxysomes ne sont donc pas essentiels à l'établissement de l'infection par HCV. Cependant, l'impact du virus sur ces organelles peut participer à sa pathogénèse. Nous avons alors tenté de déterminer l'impact de l'infection sur le métabolisme des peroxysomes. Nous avons mis en évidence une augmentation du stress oxydatif spécifiquement dans les peroxysomes de cellules Huh-7 contenant un réplicon d'HCV, corrélé à une diminution de l'activité de la catalase, l'enzyme principale de détoxification des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les peroxysomes. La diminution de l'activité de la catalase n'est pas corrélée à une diminution de son expression, ce qui suggère une inhibition de l'enzyme par HCV. Les altérations engendrées par un stress oxydatif chronique peuvent être variées, mais un lien entre défaut de régulation des ROS, vieillissement cellulaire, dommages à l'ADN et apparition de cancer a déjà été établi dans d'autres contextes. L'analyse d'échantillons de patients pourrait nous aider à déterminer les conséquences des altérations causées aux peroxysomes par l'hépatite C chronique.

Hepatitis C is a chronic disease causing progressive hepatic damage that can lead after 20 or 30 years to cirrhosis or hepatocarcinoma. The pathogen responsible for this disease is the hepatitis C virus (HCV). It is a small enveloped virus with a single-stranded positive RNA genome that infects human hepatocytes and spreads exclusively by blood contact. HCV induces oxidative stress and hijacks host-cell metabolism, especially lipid metabolism. To do so, it disturbs the morphology and function of several organelles, including endoplasmic reticulum, lipid droplets and mitochondria. Recent studies indicate that peroxisomes may also be impacted by HCV infection. Peroxisomes are small spherical organelles that are highly dynamic and versatile, adapting in number, size and function to the cellular context. They are involved in many metabolic pathways, including lipid metabolism, redox homeostasis and innate antiviral immunity. In this respect, peroxisomes are targeted by many viruses. In a screen aiming at discovering new cellular partners of viral replication complexes, we identified the peroxisomal membrane protein ACBD5. Immunostaining experiments allowed us to observe a partial recruitment of ACBD5 and other peroxisomal markers in the vicinity of HCV replication complexes in a sub-population of infected Huh-7 cells. Furthermore, peroxisome morphology appears to be altered in 20-30% of infected cells (depending on the strain used), irrespective of their recruitment. Indeed, after 16 days of infection, the average volume of peroxisomes is multiplied by 2.3, while their number is divided by 2.8 in this cell sub-population. Then, we investigated the role of peroxisomes in the HCV life cycle. To do so, we generated Huh-7 cells devoid of peroxisomes by inactivating the PEX3 gene, and Huh-7 cells lacking functional peroxisomes by inactivating the PEX5 gene, using CRISPR-Cas9 technology. These KO cells were infected with HCV strains JFH1 and DBN3a. Infectious viral particles secreted by these cells were then titered, revealing no impact on virions production. This indicates that peroxisomes are not crucial for HCV to establish infection. However, the impact of the virus on these organelles may contribute to its pathogenesis. We then sought to determine the impact of infection on peroxisome metabolism. We demonstrated an increase in oxidative stress specifically localized in the peroxisomes of Huh-7 cells containing an HCV replicon, correlated with a decrease of catalase activity, which is the main enzyme involved in peroxisomal reactive oxygen species (ROS) detoxification. The decrease of catalase activity is not accompanied by a decrease of its expression, suggesting the inhibition of this enzyme by HCV. The damages caused by chronic oxidative stress can be diverse, but a link between ROS misregulation, cellular aging, DNA damage and cancer has already been established in other contexts. Analysis of patient samples could help determine the consequences of peroxisomal damages caused by chronic hepatitis C.