N-glycosylation des protéines de membrane des coronavirus humains hautement pathogènes MERS-CoV et SARS-CoV-2

N-glycosylation of membrane proteins of human highly pathogenic coronaviruses MERS-CoV and SARS-CoV-2

• Auteur / Autrice : Dylan Juckel
• Direction : Sandrine Belouzard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 16/10/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Center for Infection and Immunity of Lille - Centre d’Infection et d’Immunité de Lille - INSERM U 1019 - UMR 9017 - UMR 8204
• Jury : Président / Présidente : Yann Guérardel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Helle
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bernard Delmas, Sophie Le Poder

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de la matrice virale

Protéines membranaires

Glycosylation

Coronavirus

Protéines membranaires

Glycosylation

SARS-CoV-2 (virus)

MERS-CoV (virus)

Mots clés libres

Glycosylation

Polylactosamines

Coronavirus

Protéine M

SARS-CoV-2

MERS-CoV

Glycosylation

Polylactosamines

Coronaviruses

M protein

SARS-CoV-2

MERS-CoV

Résumé

Les coronavirus sont des virus à ARN simple brin positif enveloppés d'une bicouche lipidique qui dérive de la cellule hôte et dans laquelle sont enchâssées les protéines S, E et M. La protéine M est une protéine transmembranaire de type III, composée d'un court ectodomaine et d'un long endodomaine. L'ectodomaine de M a la particularité de porter des N- ou O-glycanes, et ces modifications sont conservées au cours de l'évolution des coronavirus, suggérant un rôle dans le cycle infectieux. Cependant, la structure et la fonction de ces glycanes restent mal caractérisées. Nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes de glycosylation des protéines M du MERS-CoV et du SARS-CoV-2, deux coronavirus hautement pathogènes pour l'Homme.Ces deux protéines contiennent un seul site de N-glycosylation dans leur domaine N-terminal et présentent un profil de migration particulier en western-blot, avec 3 bandes dont une bande très diffuse. Des tests de digestion par des N-glycosidases ont indiqué que les sites de N-glycosylation portaient des N-glycanes riches en mannose et complexes. De plus, les N-glycanes complexes de MERS-CoV-M et SARS-CoV-2-M correspondent très probablement à des chaines de polylactosamines (poly-LacNAc).Les mécanismes régulant l'addition des poly-LacNAc sont peu connus. Ainsi, nous avons inséré des mutations dans le domaine N-terminal de MERS-CoV-M et SARS-CoV-2-M dans le but d'identifier une séquence proche du site de N-glycosylation régulant l'ajout de ces chaines. Cependant, nous n'avons pas identifié une telle séquence. En revanche, nous avons observé que les résidus acides du domaine N-terminal sont des éléments indispensables pour la glycosylation de M. En effet, la mutation des résidus E9 et D18 de MERS-CoV-M et E11, E12 et E18 de SARS-CoV-2-M en alanine a totalement aboli la glycosylation. Nous nous sommes assurés de la qualité du repliement protéique en analysant le trafic intracellulaire des mutants, ainsi que de leur topologie membranaire (N-exo/C-endo) par (i) des expériences de perméabilisations sélectives des membranes cellulaires et par (ii) l'insertion d'une séquence linker contenant un site de glycosylation dans la boucle reliant les TM2 et TM3 de M.Nous avons ensuite confirmé l'absence de séquence importante pour l'ajout de chaines de poly-LacNAc dans la protéine M en réalisant des chimères de la protéine M du SARS-CoV-2 soit avec la glycoprotéine E1 du virus de l'hépatite C soit avec la protéine accessoire ORF3a du SARS-CoV-2 dont la structure est très similaire à celle de la protéine M. L'ensemble de nos résultats suggèrent que le trafic intracellulaire dans le Golgi plutôt qu'une séquence pourrait être important pour la modification des protéines M par des chaines de poly-LacNAc.La glycosylation des protéines eucaryotes dépend de deux machineries moléculaires multimériques, OST-A et OST-B. Alors que STT3A est la sous-unité catalytique d'OST-A, STT3B est celle d'OST-B. La construction de lignées Huh-7 STT3A-KO et/ou STT3B-KO a permis d'identifier la machinerie OST-B comme étant impliquée dans la glycosylation de M.Enfin, nous avons analysé les formes de M incorporées dans les particules virales à l'aide d'un système de production de particules subvirales non infectieuses. Nos résultats indiquent qu'essentiellement la forme conjuguée à des N-glycanes riches en mannose est incorporée, ce qui est en accord avec le bourgeonnement des coronavirus dans le compartiment ERGIC.

Coronaviruses are single-stranded positive RNA viruses surrounded by a host-derived lipid bilayer in which structural proteins S, E and M are anchored. The M protein is a triple-spanning transmembrane protein, constituted of a short ectodomain and a long endodomain. The ectodomain of M carries N- or O-linked carbohydrates, which are conserved through coronaviruses evolution, indicating a function for the viral life cycle. Nevertheless, structure and function of these glycans are poorly characterized. Our work brings further knowledge about glycosylation mechanisms of the M protein of MERS-CoV and SARS-CoV-2, two highly pathogenic coronaviruses for humans.These two proteins contain a unique N-glycosylation site in their N-terminal region and show a particular migration profile in western-blot, with 3 bands amongst which one migrating as a smear. Digestion assays with N-glycosidases revealed N-glycosylation sites were modified by high-mannose and complex N-glycans. Furthermore, complex N-glycans of MERS-CoV-M and SARS-CoV-2-M could be polylactosamine chains (poly-LacNAc).Mechanisms regulating poly-LacNAc addition are not well understood. Therefore, we inserted mutations within the N-terminal domain of MERS-CoV-M and SARS-CoV-2-M in order to identify a sequence close to N-glycosylation site that could regulate poly-LacNAc addition. However, we failed to identify such a sequence. But, we observed acidic residues of the N-terminal domain as important element for glycosylation of M. Indeed, substitution of residues E9 and D18 of MERS-CoV-M, and E11, E12 and E18 of SARS-CoV-2-M totally disrupted glycosylation. We checked mutant protein folding by analyzing intracellular trafficking, as well as their membrane topology (N-exo/C-endo) by (i) selective permeabilizations of cellular membranes and (ii) by inserting a linker sequence with N-glycosylation site in the loop tethering TM2 and TM3 of M.Then, we confirmed absence of a sequence leading poly-LacNAc addition by generating chimera of SARS-CoV-2-M, either with glycoprotein E1 of hepatitis C virus, or with accessory protein ORF3a of SARS-CoV-2, whose structure is really close to the one of M. Our results suggest intracellular trafficking in the Golgi is more important for poly-LacNAc addition on M than a specific sequence.Eukaryotic proteins are glycosylated by two multimeric machineries, OST-A and OST-B. While STT3A is the catalytic subunit of OST-A, STT3B is the one of OST-B. Generation of Huh-7 STT3A-KO and/or STT3B-KO cells allowed us to identify the OST-B complex as the M protein glycosylation machinery.