Edition par CRISPR/Cas9 de la voie de biosynthèse des lactones sesquiterpéniques en vue de modifier l'amertume de la chicorée industrielle (Cichorium intybus L.)

CRISPR/Cas9 editing of the sesquiterpene lactone biosynthetic pathway to modify the bitterness in industrial chicory (Cichorium intybus L.)

• Auteur / Autrice : Justine Domont
• Direction : Caroline Rambaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies agroalimentaires, sciences de l'aliment, physiologie
• Date : Soutenance le 21/03/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Lille ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : UMR Transfrontalière BioEcoAgro - Institut Charles Viollette
• Jury : Président / Présidente : Jean-Louis Hilbert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Jullian-Pawlicki, Marwa Roumani
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Hugueney, Vincent Courdavault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfection

Rhizobactéries

Protoplastes

CRISPR-Cas9

Amertume (goût)

Sesquiterpènes

Analyse sensorielle

Amélioration génétique

Chicorée sauvage

Mots clés libres

Lactones sesquiterpéniques

Chevelus racinaires

Chicory

Bitterness

CRISPR/Cas9

Sesquiterpene lactones

Protoplasts

Hairy roots

Résumé

La chicorée industrielle (Cichorium intybus var. sativum) est une plante emblématique de la Région Hauts-de-France. Cette plante est connue pour ses vertus thérapeutiques, ses propriétés nutritionnelles, mais aussi pour son goût amer. Les racines de chicorée industrielle sont habituellement utilisées pour la production de substitut de café et la production d'inuline. Le développement de nouveaux ingrédients fonctionnels à base de chicorée, nécessite de créer des variétés moins amères, car l'amertume constitue un frein à la consommation. Cette amertume est principalement due à la présence de lactones sesquiterpéniques, des métabolites spécialisés dont la voie de biosynthèse est partiellement élucidée. Dans ce cadre, une caractérisation des gènes impliqués dans la synthèse des lactones sesquiterpéniques a été entreprise sur le génome de la chicorée industrielle ChicBitter002. La chicorée ChicBitter002 présente de nombreux avantages pour la recherche expérimentale puisque c'est un clone dont la propagation in vitro est maîtrisée au sein du laboratoire, capable de s'autoféconder, pour laquelle une méthode d'édition par CRISPR/Cas9 a été mise au point, et dont la séquence du génome est disponible auprès de l'entreprise partenaire, Florimond-Desprez. Ainsi, 10 gènes ont été identifiés parmi lesquels, les gènes germacrène A synthase (GAS), sous forme longue ou courte, le gène germacrène A oxydase (GAO), et les gènes costunolide synthase (COS). Dans le but d'établir une preuve de concept que l'inhibition des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des lactones sesquiterpéniques provoque une diminution de l'amertume, la chicorée Chicbitter002 a été éditée via une transformation stable par R. rhizogenes, permettant une régénération rapide de plantes ainsi qu'une efficacité d'édition élevée (26%). Afin de générer des mutants, les gènes GAS et GAO ont été ciblés. L'étude des mutants obtenus a permis de valider que la mutation bi-allélique d'au moins deux copies (GAS-S1 et GAS-S2) de la forme courte du gène GAS ou du gène GAO provoque une réduction significative de la production de lactones sesquiterpéniques. Une corrélation entre ces molécules et la perception de l'amertume, établie par analyse sensorielle, a aussi permis d'obtenir des scores d'amertume pour les mutants GAS-S1 et GAS-S2 générés, bien inférieurs à ceux des témoins. L'édition par CRISPR/Cas9 a ensuite pu être réalisée sur un matériel végétal d'intérêt appliqué, utilisé pour la génération de nouvelles variétés de chicorée et créé par les sélectionneurs. La méthode utilisée a été celle de la transfection de protoplastes, mise au point au sein du laboratoire, et que nous avons optimisée. La méthode est plus longue pour obtenir des mutants mais présente l'avantage de générer des plantes exemptes de transgènes. De nombreux mutants ont pu être générés dont la validation par une analyse métabolique reste à réaliser.

The industrial chicory (Cichorium intybus var. sativum) is an emblematic plant of the Hauts-de-France region. This plant is known for its therapeutic and nutritional properties, but also for its bitter taste. Industrial chicory roots are usually used for the production of coffee substitute and inulin production. The development of new functional ingredients based on chicory requires the creation of less bitter varieties, as bitterness is a barrier to consumption. This bitterness is mainly due to the presence of sesquiterpene lactones, specialized metabolites whose biosynthetic pathway is partially elucidated. In this context, a characterization of the genes involved in the synthesis of sesquiterpene lactones was realized in the industrial chicory ChicBitter002 genome. ChicBitter002 chicory offers many advantages for experimental research since it is a clone whose in vitro propagation is mastered in the laboratory, capable of self-fertilization, for which a CRISPR/Cas9 editing method has been developed, and whose genome sequence is available from the partner company, Florimond-Desprez. Thus, 10 genes were identified, including the germacrene A synthase (GAS) genes, in long or short form, the germacrene A oxidase (GAO) gene, and the costunolide synthase (COS) genes. In order to establish a proof of concept that inhibition of genes involved in the sesquiterpene lactone biosynthetic pathway causes a decrease in bitterness, Chicbitter002 chicory was edited via a stable transformation by R. rhizogenes, allowing a rapid plant regeneration and a higher mutation efficiency (26%). In order to generate mutants, the GAS and GAO genes were targeted. The study of these mutants allowed to validate that the bi-allelic mutation of at least two copies (GAS-S1 and GAS-S2) of the short form of the GAS gene or of the GAO gene causes a significant reduction in the production of sesquiterpene lactones. A correlation between these molecules and bitterness perception, established by sensory analysis, also resulted in bitterness score for the GAS-S1 and GAS-S2 mutants that were significantly lower than those of controls. CRISPR/Cas9 editing could then be performed on plant material of applied interest, used for the generation of new chicory varieties and created by breeders. The method used was protoplast transfection, developed in the laboratory, which we optimized. This method is more time consuming to obtain mutants but has the advantage of generating transgene-free plants. Numerous mutants have been generated and their validation by metabolic analysis remains to be done.