Edition par CRISPR/Cas9 de la voie de biosynthèse des lactones sesquiterpéniques en vue de modifier l'amertume de la chicorée industrielle (Cichorium intybus L.)
Auteur / Autrice : | Justine Domont |
Direction : | Caroline Rambaud |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Biotechnologies agroalimentaires, sciences de l'aliment, physiologie |
Date : | Soutenance le 21/03/2023 |
Etablissement(s) : | Université de Lille (2022-....) |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Lille ; 1992-....) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : UMR Transfrontalière BioEcoAgro - Institut Charles Viollette |
Jury : | Président / Présidente : Jean-Louis Hilbert |
Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Jullian-Pawlicki, Marwa Roumani | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Hugueney, Vincent Courdavault |
Mots clés
Résumé
La chicorée industrielle (Cichorium intybus var. sativum) est une plante emblématique de la Région Hauts-de-France. Cette plante est connue pour ses vertus thérapeutiques, ses propriétés nutritionnelles, mais aussi pour son goût amer. Les racines de chicorée industrielle sont habituellement utilisées pour la production de substitut de café et la production d'inuline. Le développement de nouveaux ingrédients fonctionnels à base de chicorée, nécessite de créer des variétés moins amères, car l'amertume constitue un frein à la consommation. Cette amertume est principalement due à la présence de lactones sesquiterpéniques, des métabolites spécialisés dont la voie de biosynthèse est partiellement élucidée. Dans ce cadre, une caractérisation des gènes impliqués dans la synthèse des lactones sesquiterpéniques a été entreprise sur le génome de la chicorée industrielle ChicBitter002. La chicorée ChicBitter002 présente de nombreux avantages pour la recherche expérimentale puisque c'est un clone dont la propagation in vitro est maîtrisée au sein du laboratoire, capable de s'autoféconder, pour laquelle une méthode d'édition par CRISPR/Cas9 a été mise au point, et dont la séquence du génome est disponible auprès de l'entreprise partenaire, Florimond-Desprez. Ainsi, 10 gènes ont été identifiés parmi lesquels, les gènes germacrène A synthase (GAS), sous forme longue ou courte, le gène germacrène A oxydase (GAO), et les gènes costunolide synthase (COS). Dans le but d'établir une preuve de concept que l'inhibition des gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des lactones sesquiterpéniques provoque une diminution de l'amertume, la chicorée Chicbitter002 a été éditée via une transformation stable par R. rhizogenes, permettant une régénération rapide de plantes ainsi qu'une efficacité d'édition élevée (26%). Afin de générer des mutants, les gènes GAS et GAO ont été ciblés. L'étude des mutants obtenus a permis de valider que la mutation bi-allélique d'au moins deux copies (GAS-S1 et GAS-S2) de la forme courte du gène GAS ou du gène GAO provoque une réduction significative de la production de lactones sesquiterpéniques. Une corrélation entre ces molécules et la perception de l'amertume, établie par analyse sensorielle, a aussi permis d'obtenir des scores d'amertume pour les mutants GAS-S1 et GAS-S2 générés, bien inférieurs à ceux des témoins. L'édition par CRISPR/Cas9 a ensuite pu être réalisée sur un matériel végétal d'intérêt appliqué, utilisé pour la génération de nouvelles variétés de chicorée et créé par les sélectionneurs. La méthode utilisée a été celle de la transfection de protoplastes, mise au point au sein du laboratoire, et que nous avons optimisée. La méthode est plus longue pour obtenir des mutants mais présente l'avantage de générer des plantes exemptes de transgènes. De nombreux mutants ont pu être générés dont la validation par une analyse métabolique reste à réaliser.