Automatisation de l'AFM pour la caractérisation mécanique des échantillons biologiques à différentes échelles

AFM automation for mechanically characterizing biological samples at different scales

• Auteur / Autrice : Javier Lopez Alonso
• Direction : Vincent Duprès
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Micro-nanosystèmes et capteurs
• Date : Soutenance le 20/09/2023
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de l’ingénierie et des systèmes (Lille ; 2021-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Center for Infection and Immunity of Lille
• Jury : Président / Présidente : Bruno Grandidier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Kislon Voitchovsky, Patricia Maria Losada-Pérez, Frank Lafont, Nuria Gavara
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Grégory Francius, Etienne Dague

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biophysique

Analyse multiéchelle

Vésicules extracellulaires

Tissus (histologie)

Échantillons biologiques

Matrice extracellulaire

Propriétés mécaniques

Cellules

Automatisation

Microscopie à force atomique

Mots clés libres

Nanovésicules artificielles

Mechanical Properties

Artificial nanovesicles

Atomic Force Microscopy

Automation

Résumé

Ces dernières années, l'étude de la mécanique des cellules et de la matrice extracellulaire (MEC) a connu un essor considérable, en raison de la reconnaissance de son rôle crucial dans les processus physiologiques et pathologiques tels que la division cellulaire, la migration, la différenciation et la malignité. La microscopie à force atomique (AFM) s'est imposée comme une technique parfaitement adaptée à l'étude des propriétés mécaniques des cellules vivantes et de la matrice extracellulaire, offrant des mesures de rigidité, d'élasticité, d'adhésion et de viscoélasticité. Toutefois, l'efficacité de l'AFM dans la recherche biologique est limitée par sa dépendance à l'égard d'utilisateurs qualifiés et par son faible rendement. Pour surmonter ces difficultés, les chercheurs se sont efforcés à améliorer le débit de l'AFM afin d'accroître son efficacité et de permettre l'acquisition d'ensembles de données plus importants.Dans ce travail, nous proposons un système automatisé basé sur la détection d'objets qui incorpore des algorithmes pour garantir la qualité des données acquises. Pour démontrer la viabilité du système AFM automatisé que nous avons mis au point, nous avons effectué des tests sur trois échantillons couramment étudiés à l'aide de l'AFM, chacun à une échelle de taille différente.Tout d'abord, nous avons mené des expériences sur des nanovésicules artificielles avec trois mélanges de lipides différents et trois tailles d'extrusion différentes. Dans nos résultats, nous avons observé que la théorie de l'enveloppe mince est moins affectée par la taille des NVs et fournit une meilleure description des propriétés mécaniques des NVs que le modèle de Hertz. Le développement de protocoles automatisés d'acquisition et d'analyse des données ouvre la voie à l'établissement d'une méthodologie pouvant être appliquée aux vésicules extracellulaires dérivées de cellules dans des conditions pathologiques et non pathologiques.En outre, nous avons traité des cellules épithéliales de pigment rétinien immortalisées par la télomérase inverse (hTERT-RPE-1) avec de la latrunculine-A, confirmant une diminution du module de Young apparent (E) par rapport aux cellules non traitées. Ceci valide l'application de notre système aux cellules de mammifères.En intégrant un algorithme de suivi, nous avons analysé les propriétés mécaniques des fibroblastes NIH3T3 en migration sur le verre au fil du temps. Nous avons observé que le rapport E avant-arrière et le rapport E bord d'attaque/bord pour des cellules NIH3T3 en migration sont faiblement corrélés à la vitesse de migration, mais pas à l'angle de migration ni aux changements de l'angle de migration de la cellule. Cela suggère que même lorsque les cellules se déplacent dans une direction particulière, elles explorent constamment d'autres chemins.En outre, nous avons adapté avec succès le système pour mesurer l'empreinte mécanique des tissus de la vessie de rat. Nos expériences automatisées ont capturé avec succès l'empreinte mécanique des échantillons de tissus, révélant les trois régions mécaniques distinctes et obtenant des valeurs cohérentes avec les études précédentes.En plus du système AFM automatisé, nous avons développé un logiciel libre pour mesurer les propriétés élastiques et viscoélastiques à partir des données AFM. Le logiciel a été validé par rapport à des scripts MATLAB et à des logiciels commerciaux.Ce travail contribue à l'avancement de la recherche biophysique en introduisant un nouveau système AFM automatisé capable de caractériser les propriétés mécaniques de divers échantillons biologiques et un logiciel libre pour extraire les propriétés élastiques et viscoélastiques des données AFM.

In recent years, there has been a significant rise in the study of cellular and extracellular matrix (ECM) mechanics, driven by the recognition of its crucial role in physiological and pathological processes such as cell division, migration, differentiation, and malignancy. Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a powerful technique for investigating the mechanical properties of living cells and ECM, offering measurements of stiffness, elasticity, adhesion, and viscoelasticity. However, AFM's effectiveness in biological research is limited by its reliance on skilled users and its low throughput. To overcome these challenges, researchers have been working on enhancing AFM's throughput to improve efficiency and enable the acquisition of larger data sets.In this work, we propose an automated system based on object detection that incorporates algorithms to ensure the quality of the acquired data. To demonstrate the viability of our developed automated AFM system, we conducted tests on three samples commonly studied using AFM, each at a different size scale.First, we conducted experiments on artificial nanovesicles (NVs) with three different lipid mixtures and three different extrusion sizes. In our results we observed that the Thin Shell theory is less affected by the NVs size and provides a better description of the NVs' mechanical properties than the Hertz Model. The development of automated data acquisition and data analysis protocols, pave the way for establishing a methodology that can be applied to cell-derived extracellular vesicles under both pathological and non-pathological conditions.Additionally, we treated Telomerase Reverse Transcriptase immortalized Retinal Pigment Epithelial (hTERT-RPE-1) cells with Latrunculin-A, confirming a decrease in the apparent Young's modulus (E) compared to non-treated cells. This validates the application of our system to mammalian cells.By integrating a tracking algorithm, we monitored the mechanical properties of migrating NIH3T3 fibroblasts on glass over time. We observed that the front-to-back E ratio and the leading edge/following edge E ratio of migrating NIH3T3 cells are weakly correlated with the migration speed but not with the migration angle or changes in the migration angle of the cell. Suggesting that even when cells are moving in a particular direction, they are constantly probing alternative paths.Furthermore, we successfully adapted the system to measure the mechanical fingerprint of rat bladder tissue. Our automated experiments successfully captured the mechanical fingerprint of the tissue samples, revealing the three distinct mechanical regions and obtaining values consistent with previous studies.In addition to the automated AFM system, we developed an open-source software package for measuring elastic and viscoelastic properties from AFM data. The software was validated against MATLAB scripts and commercial software.This work contributes to the advancement of biophysical research by introducing a novel automated AFM system capable of characterizing the mechanical properties of diverse biological samples and an open-source software package for extracting elastic and viscoelastic properties from AFM data.