Décrypter les mécanismes moléculaires de deux variants TFAM et mtSSB impliqués dans des pathologies d'origine mitochondriale

Unravelling the molecular mechanisms of TFAM and mtSSB variants in mitochondrial diseases : a single molecule approach

• Auteur / Autrice : Martial Martucci
• Direction : Siet Van den Wildenberg, Géraldine Farge
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Milieux dilués et optique
• Date : Soutenance le 14/12/2023
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne (2021-...)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences fondamentales (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Physique de Clermont
• Jury : Président / Présidente : Jean Orloff
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurence Vandel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cécile Delettre-Cribaillet, Zdenek Lansky

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions ADN-protéine

ADN mitochondrial

Mots clés libres

Maintenance de l'ADNmt

Mutation à l'origine de maladies

Tfam

Ssb

Afs

Tirf

MtDNA maintenance

Disease-Causing mutant

Tfam

Ssb

Afs

Tirf

Résumé

Les mitochondries sont des organites présentes chez les cellules eucaryotes et sont essentielles à la production d’énergie via la phosphorylation oxydative, qui synthétise de l’ATP nécessaire aux réactions du métabolisme. Les mitochondries possèdent leur propre génome de 16,5 kb de long et dont la réplication et l’expression se font indépendamment du noyau et qui est associé en permanence avec des protéines, formant une structure nucléoprotéique appelée le nucléoide. Parmi ces protéines, certaines sont considérées comme étant des acteurs principaux du nucléoide mitochondrial et ont été étudiées en profondeur comme l’ADN polymérase POLγ, l’hélicase TWINKLE, l’ARN polymérase POLRMT, le facteur de transcription mitochondrial A TFAM et plus récemment la protéine de liaison à l’ADN mitochondrial simple brin SSB. Des mutations au sein de ces protéines altèrent grandement l’intégrité de l’ADN mitochondrial et le nombre de ses copies, entraînant des délétions au niveau de cet ADN ou une déplétion allant avec des pathologies souvent graves. Avec le développement de méthodes permettant la manipulation individuelle de molécules d’ADN ainsi que l’essor de la microscopie à fluorescence, des techniques dites “single molecule” ont émergées dans les vingt dernières années et ont permis la compréhension des mécanismes d’interaction ADN-protéines au niveau de la molécule. Dans cette thèse, nous avons utilisé deux single molecule techniques: la spectroscopie de force acoustique (AFS) et la microscopie à fluorescence par réflexion interne total (TIRFm) couplée avec la manipulation de molécules d’ADN par courant microfluidique dans le but d’étudier les mécanismes d’interaction avec l’ADN de deux variants à l’origine de défaillances dans la maintenance de l’ADNmt, à savoir TFAM P178L et mtSSB R107Q.

Mitochondria are organelles within eukaryotic cells that are essential to produce energy by the oxidative phosphorylation process, that synthesises ATP required for metabolism reactions. Mitochondria possess their own genome of 16,5 kb of which its replication and expression are independent of the nucleus and which is permanently bound with proteins, forming a nucleoprotein structure called nucleoid. Among these proteins, some are found to form a core component of the mitochondrial nucleoids and have been well characterised such as the polymerase POLγ, the helicase TWINKLE, the RNA polymerase POLRMT, the mitochondrial transcription factor A TFAM or more recently the mitochondrial single stranded binding protein mtSSB. Mutations within these proteins greatly affect mtDNA integrity and copy number, leading to mtDNA deletion and depletion going with often severe diseases. With the development of DNA molecule manipulation techniques and fluorescence microscopy in the past two decades, single molecule methods have arisen and enable the understanding of DNA-protein interaction mechanisms at a single molecule level. In this thesis, we employed two single molecule techniques: the acoustic force spectroscopy (AFS) and the total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFm) coupled with DNA fluid flow manipulation in order to give insight about the disease related mechanism of two mitochondrial maintenance protein variants involved in mitochondrial maintenance defect, namely TFAM P178L and mtSSB R107Q.