Caractérisation de NUDT6 et NUDT9, deux protéines de la famille NUDIX à localisation mitochondriale

Characterization of NUDT6 and NUDT9, two proteins of the NUDIX family with mitochondrial localization

• Auteur / Autrice : Louis Debar
• Direction : Géraldine Farge
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 20/03/2023
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne (2021-...)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Physique de Clermont (2017-....)
• Jury : Président / Présidente : Ruddy Richard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvie Baudino, Olivier Da Ines, Anne-Catherine Maurin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nina Entelis, Olivier Baris, Sylvie Baudino

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mitochondries

Mots clés libres

Protéines NUDIX

Mitochondrie

Nudt6

Nudt9

Nad(h)

ADP-Ribose

NUDIX proteins

Mitochondria

Nudt6

Nudt9

Nad(h)

ADP-Ribose

Résumé

Les protéines de la famille NUDIX (Nucleoside Diphosphatase lié à un autre groupement X) sont caractérisées par une boite NUDIX leur conférant une activité pyrophophohydrolase dirigée contre divers nucléosides. Au nombre de 24 chez l'humain, certaines protéines NUDIX ont déjà été caractérisées comme étant essentielles pour la dégradation de nucléotides oxydés, de coiffes d'ARNs, ou de dinucléotides tels que le NAD ou le FAD. Outre cette large gamme de substrats enzymatiques, les protéines NUDIX peuvent également être localisées dans différents compartiments cellulaires, principalement dans le noyau et dans le cytosol, mais aussi dans le peroxysome et dans les mitochondries. Ici, nous nous sommes intéressés à deux membres potentiellement mitochondriaux de cette famille: NUDT6 et NUDT9. NUDT6 n'est pas encore caractérisé et a été uniquement étudié pour son rôle comme antisens de l'ARNm du gène FGF2, un facteur de croissance des fibroblastes. Pour NUDT9, la protéine a été plus étudié et possède une activité d'hydrolyse de l'ADP-ribose, une molécule centrale dans les phénomène d'ADP-ribosylation, une modification post-traductionnelle, cependant son rôle dans la mitochondrie est encore inconnu.Pour étudier ces deux protéines, nous avons généré et utilisé des lignées cellulaires où les gènes de NUDT6 et/ou NUDT9 ont été inactivés par le système CRISPR/Cas (Knockout ou KO) ou par siRNA (Knockdown ou KD). Nous avons tout d'abord montré que NUDT6 est exprimé dans les cellules humaines et est localisé exclusivement dans les mitochondries et nous avons confirmé que NUDT9 a une localisation mitochondriale. nous avons également observé que l'absence de l'une ou l'autre de ces protéines entraîne des perturbations du cycle cellulaire. Au niveau mitochondrial, l'absence de ces protéines entraîne une augmentation de la respiration et de la quantité de certains ARNm, sans que le volume total mitochondrial soit modifié. Les mesures du contenu cellulaire en nucléotides semblent indiquer une activité de NUDT6 et NUDT9 contre le NAD(H), le FAD et l'ADP-ribose (ADPR). Nous avons confirmé in vitro que NUDT6 peut hydrolyser une large gamme de substrats tels que le NAD(H), le FAD et l'ADPR et que NUDT9 a une activité plus ciblée, qui dépend davantage du cofacteur utilisé, qui cible principalement l'ADPR.

The proteins of the NUDIX family (Nucleoside Diphosphatase linked to another group X) are characterized by a NUDIX box giving them a pyrophophohydrolase activity directed against various nucleosides. Twenty-four members of this family are found in humans, and some NUDIX proteins have already been characterized as being essential for the degradation of oxidized nucleotides, RNA caps, or dinucleotides such as NAD or FAD. Besides this wide range of enzymatic substrates, NUDIX proteins can also be located in different cellular compartments, mainly in the nucleus and in the cytosol, but also in the peroxisome and in the mitochondria. Here, we were interested in two potentially mitochondrial members of this family: NUDT6 and NUDT9. NUDT6 is not yet characterized and has only been studied for its role as an antisense mRNA of the FGF2 gene, a fibroblast growth factor. For NUDT9, the protein has been more studied and has an activity of hydrolysis of ADP-ribose, a central molecule in the phenomenon of ADP-ribosylation, a post-translational modification, however its role in the mitochondria is still unknown .To study these two proteins, we generated and used cell lines where the NUDT6 and/or NUDT9 genes were inactivated by the CRISPR/Cas system (Knockout or KO) or by siRNA (Knockdown or KD). We first showed that NUDT6 is expressed in human cells and is localized exclusively in the mitochondria and we confirmed that NUDT9 has a mitochondrial localization. we have also observed that the absence of either of these proteins leads to disturbances in the cell cycle. At the mitochondrial level, the absence of these proteins leads to an increase in respiration and in the quantity of certain mRNAs, without the total mitochondrial mass being modified. Measurements of cellular nucleotide content suggest activity of NUDT6 and NUDT9 against NAD(H), FAD and ADP-ribose (ADPR). We confirmed in vitro that NUDT6 can hydrolyze a wide range of substrates such as NAD(H), FAD and ADPR and that NUDT9 has a more targeted activity, which is more dependent on the cofactor used, which mainly targets ADPR .