La protéine de stress GRP94, le complément C3 et la cathepsine L : expression, interactions et contribution à la physiopathologie de l’obésité et de la dépendance à la méthamphétamine

The stress protein GRP94, complement C3 and cathepsin L : expression, interactions, and contribution to pathophysiology in obesity and methamphetamine addiction

• Auteur / Autrice : Fangmin Wang
• Direction : Évelyne Kohli, Michel Narce
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Médecine, cancérologie, génétique, hématologie, immunologie
• Date : Soutenance le 21/11/2023
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté en cotutelle avec Ningbo University
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche Translationnelle en Médecine moléculaire (CTM) (Dijon)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Bourgogne (1970-2024)
• Jury : Président / Présidente : Yu Liu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Wenhua Zhou, Fabienne Laugerette, Jiang Du
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Agnès Dragon-Durey, Yanhui Liao

Mots clés

Mots clés contrôlés

Complément C3

Cathepsine L

Méthamphétamine

Obésité

Mots clés libres

Grp94

Complement C3

Cathepsin L

Obesité

Methamphétamine

Stress du réticulum endoplasmique

Grp94

Complement C3

Cathepsin L

Obesity

Methamphetamine

Endoplasmic reticulum stress

Résumé

Des études antérieures de l'équipe ont montré que des macrophages M2 humains primaires traités avec la thapsigargine, un inducteur de stress du réticulum endoplasmique (RE), subissaient un changement phénotypique M2-M1, dépendant de la protéine de stress GRP94. Dans ces conditions, GRP94 favorise la sécrétion du complément C3 et de la cathepsine L.Les objectifs de cette thèse de Cotutelle étaient d'étudier l'association de GRP94 avec C3 et/ou la cathepsine L dans deux situations pathologiques où le stress du RE est impliqué, l'obésité et l'addiction à la méthamphétamine (METH).Les macrophages du tissu adipeux (ATM) sont des acteurs clés dans la physiopathologie des maladies liées à l'obésité, contribuant à l'inflammation chronique et présentant un phénotype d'activation métabolique unique. Nous avons analysé l'expression de GRP94 dans les ATM de souris de type sauvage ou transgéniques fat-1 soumises à un régime riche en graisses et en saccharose. Chez les souris obèses de type sauvage, mais pas chez les souris fat-1, qui résistent à l'obésité, nous avons observé des structures en forme de couronne autour des adipocytes, contenant des macrophages CD206+ exprimant pSTAT1 et des niveaux élevés de GRP94 colocalisant avec le complément C3 et la cathepsine L. Des expériences in vitro ont montré que l'acide palmitique (PA), induisait un switch M2-M1 dépendant de GRP94. Le PA induit une interaction entre GRP94 et la cathepsine L et une diminution de l'activité enzymatique de la cathepsine L pouvant être prévenue par l’inhibiteur de GRP94, PU-WS13. En outre, le PU-WS13 inhibe la colocalisation sur la membrane cellulaire de la cathepsine L induite par le PA avec LAMP1, un marqueur lysosomal, suggérant un rôle de GRP94 dans la sécrétion de la cathepsine L par exocytose lysosomale, un processus nécessaire à l'élimination des adipocytes morts.La méthamphétamine (METH) est un stimulant du système nerveux central qui crée une forte dépendance et est neurotoxique. La neuroinflammation est suspectée jouer un rôle. Le complément C3 joue un rôle crucial dans la neuroinflammation en activant les cellules microgliales via notamment l'activation des récepteurs C3aR, mais il n'a pas été étudié dans l’addiction à la METH. Cette étude vise à étudier l'association entre le stress du RE, GRP94 et C3 dans le cerveau et l'intestin dans un modèle d’addiction à la METH chez le rat. Les résultats montrent que, dans le cortex préfrontal, après 14 ou 28 jours d'auto-administration de METH, i) la voie ATF6 de la réponse aux protéines non repliées est activée ii) TLR4 et NF-κB augmentent iii) GRP94 et C3 augmentent et colocalisent dans les neurones et les cellules microgliales iv) C3aR est augmenté dans les neurones et les cellules microgliales recrutées autour des neurones. Dans le côlon, GR94 et C3 sont surexprimés dans les macrophages et dans les neurones du plexus myentérique. Le traitement des rats avec le facteur de venin de cobra, un facteur de déplétion de C3, diminue la consommation de METH, la surexpression de C3/ C3aR et de GRP94 dans le cortex préfrontal. Des résultats préliminaires montrent que l'inhibiteur GRP94 inhibiteur-1 diminue la prise de METH.Enfin, nous avons également observé que l'ibudilast, un antagoniste de TLR4, inhibe les comportements addictifs dans notre modèle et réduit l'expression de GRP94 et de C3.Les résultats présentés montrent l'importance de GRP94 dans les deux situations de stress du RE étudiées. Dans l'obésité, GRP94 joue un rôle crucial dans les macrophages M2 lors de l’activation métabolique, et son interaction avec la cathepsine L pourrait représenter un processus clé dans le switch pro-inflammatoire observé. Dans la dépendance à la METH, elle joue également un rôle crucial car son inhibition peut diminuer la consommation de METH. Le mécanisme implique probablement le complément C3.Ces résultats apportent des preuves expérimentales pour cibler GRP94, C3, ou TLR4 dans l'addiction à la METH.

Previous studies of the team have shown that primary human M2 macrophages undergo a phenotypic shift towards a more pro-inflammatory state upon treatment with the endoplasmic reticulum (ER) stress inducer thapsigargin, dependent on the stress protein GRP94. In these conditions, GRP94 promoted the secretion of complement C3 and cathepsin L.The objectives of this Cotutelle thesis were to study GRP94 association with complement C3 and/or cathepsin L in two pathologic situations where ER stress is involved, obesity and methamphetamine addiction.Adipose tissue macrophages (ATMs) are key players in the pathophysiology of obesity-related diseases, contributing to chronic low-grade inflammation. They exhibit a unique metabolic activation phenotype, transitioning from M2 to M1. We analyzed GRP94 expression in ATMs from wild-type or transgenic fat-1 mice subjected to a high-fat/high-sucrose (HFHS) or a normal diet. In obese wild-type, but not in fat-1 mice which resist to obesity, fed a HFHS diet, we observed crown-like structures around adipocytes containing CD206+ macrophages expressing pSTAT1 and high levels of GRP94 that colocalized with complement C3 and cathepsin L. In vitro experiments showed that palmitic acid (PA), a metabolic activator, induced ER stress and favored a M2-M1 switch depending on GRP94. PA induced GRP94-cathepsin L interaction and a decrease in cathepsin L enzymatic activity that was prevented by the GRP94 inhibitor PU-WS13. Moreover, in macrophages, PU-WS13 inhibited PA-induced colocalization on the cell membrane of cathepsin L with LAMP1, a lysosomal marker, suggesting a role for GRP94 in promoting cathepsin L secretion through lysosomal exocytosis, a process required to clear dead adipocytes.Methamphetamine (METH) is a central nervous system stimulant that is highly addictive and neurotoxic. Neuroinflammation has been linked to METH addiction, but the mechanisms are not yet fully understood. Complement C3 plays a crucial role in neuroinflammation by activating microglia through the activation of C3aR receptors but has not been investigated in METH addiction. This study investigates the association between ER stress, GRP94 and C3 in the brain and the gut in a rat model of METH addiction. The results demonstrate that, in the prefrontal cortex, after 14 or 28 days of METH self-administration, i) the unfolded protein response ATF6 pathway is activated ii) TLR4 and NF-κB increase iii) GRP94 and C3 increase and colocalize in neurons and microglia iv) C3aR expression is increased in neurons and in microglia which are recruited around neurons. In the colon, GR94 and C3 are overexpressed in lamina propria and muscularis macrophages as well as in neurons in the myenteric plexus. Moreover, treatment of rats with cobra venom factor, a C3 depleting factor, decreased METH intake, overexpression of C3/C3aR and GRP94 in the prefrontal cortex as well as microglia-neuron interactions and preliminary results showed that GRP94 inhibitor-1 decreased METH intake.Finally, we also observed that the TLR4 antagonist ibudilast inhibits METH self-administration behavior in rats and decreased the rewarding motivation and relapse behavior of METH. Moreover, ibudilast reduced the expression of GRP94 and C3.Altogether, the results presented show the importance of GRP94 in the two ER stress situations studied. In obesity, GRP94 plays a crucial role in metabolically activated M2 macrophages, and its interaction with cathepsin L may represent a key process in the pro-inflammatory shift triggered by metabolic activation. In METH addiction, it also plays a crucial role as its inhibition can decrease METH intake. The mechanism probably involves complement C3.These findings provide experimental evidence for targeting complement C3, GRP94 or TLR4 in METH addiction.