Mécanique de la phagocytose chez les macrophages humains : dynamique du cytosquelette et mesure de forces

Mechanics of human macrophages phagocytosis : cytoskeleton dynamics and force measurment

• Auteur / Autrice : Claire Bigot
• Direction : Renaud Poincloux, Laurent Malaquin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 30/06/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie et de biologie structurale (Toulouse ; 1996-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Vieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jacques Fattaccioli
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Emmanuèle Helfer, Sophie Féréol

Mots clés

Mots clés contrôlés

Actine

Cytosquelette

Phagocytose

Mots clés libres

Phagocytose

Actine

Macrophage

Podosome

Mécanobiologie

Microfabrication

Phagocytosis

Actin

Macrophage

Podosome

Mechanosensing

Microfabrication

Résumé

La phagocytose est un processus clé de notre immunité et homéostasie, consistant à détecter et capturer de larges particules (> 0,5 µm). Ce mécanisme est notamment mis en œuvre par des cellules immunitaires spécialisées comme les macrophages, des phagocytes professionnels responsables de l'élimination des cellules apoptotiques, débris et micro-organismes. Les macrophages interagissent continuellement avec leur environnement, et adaptent leur comportement en réaction aux propriétés mécaniques de ce dernier, un phénomène appelé mécanosensibilité. Chez les macrophages, les acteurs majeurs de cette fonction sont les podosomes, des structures d'adhérence qui permettent de sonder l'environnement extracellulaire en appliquant des forces protrusives. La phagocytose a été décrite comme un processus mécanosensible. En effet, il semble que plus les particules cibles sont rigides, plus elles seront capturées efficacement. Dès lors, l'étude des podosomes au niveau des phagosomes est une voie privilégiée pour la compréhension du processus global de phagocytose. Une première partie de ce travail a d'abord visé à étudier la présence de structures de types podosomes au niveau des phagosomes. Des essais de phagocytose ont été réalisés sur des billes de polystyrène et du Zymosan opsonisés par des IgG (phagocytose Fcɣ) ou non opsonisés. Lors de la phagocytose Fcɣ, des structures punctiformes d'actine apparaissent au niveau des coupes phagocytaires et des phagosomes clos. La caractérisation par microscopie de fluorescence super-résolue de ces points d'actine a révélé une structure similaire à celle des podosomes en termes de taille, durée de vie et de composition protéique. Nous les avons ainsi dénommés PAPs pour Podosomes Associés aux Phagosomes. Comme dans le cas des podosomes, qui sont ciblés par des vésicules contenant des protéases, la présence de PAPs est corrélée à la maturation des phagosomes en phagolysosomes. Une deuxième partie concerne le développement d'une méthode permettant l'étude des mécanismes moléculaires impliquées dans la génération de forces au cours de la phagocytose. En effet, ces mécanismes sont encore mal documentés, principalement à cause de l'absence de méthode simple d'évaluation de ces forces sur un grand nombre de cellules vivantes. La méthode ici proposée combine des mesures de compression à des mesures de traction. Cette méthode repose sur l'analyse des forces appliquées par les macrophages phagocytant des micro piliers de polyacrylamide de taille et de rigidité contrôlées. Les déviations et variations de rayons des piliers au cours de la phagocytose sont mesurés en routine avec une précision nanométrique. Des simulations mécaniques ont ensuite permis d'estimer l'amplitude et la direction des forces de compression et de traction impliquées. Nous avons ensuite montré que la contractilité de l'actomyosine est responsable de la contraction du pilier. Enfin, ce modèle de phagocytose frustrée a permis d'analyser la dynamique des forces générées sur plusieurs heures et sur un grand nombre de cellules en parallèle, et a révélé que les forces de traction et de compression ne sont pas nécessairement couplées et que l'énergie totale de déformation des piliers diminue avec le nombre d'événements de phagocytose, ce qui suggère que les macrophages sont plus efficaces pour phagocyter une seule particule à la fois. Ce travail a donc permis de mettre en évidence la présence de podosomes au niveau des phagosomes clos dans la phagocytose médiée par les récepteurs Fc, et leur corrélation avec la maturation du phagosome. Il propose également une méthode originale qui devrait permettre de mettre en évidence quels sont les acteurs moléculaires impliqués dans la génération de force au cours de la phagocytose.

Phagocytosis is a key process of our immunity and homeostasis, consisting in detecting and capturing large particles (> 0.5 µm). This mechanism is performed by specialized immune cells such as macrophages, professional phagocytes responsible for eliminating apoptotic cells, debris and microorganisms. They continuously interact with their tissue environment to probe and adapt their behaviour in response to perceived mechanical changes, a phenomenon called mechanosensing. In macrophages, the major players in this function are the podosomes, adhesion structures that probe the extracellular environment by applying protrusive forces. Phagocytosis is a mechanosensitive process: the greater the rigidity of the target particles, the more efficiently they are captured. Investigating podosomes at the level of phagosomes is a privileged and novel way to study the global process of phagocytosis. The first part of this work describes the presence of podosome-like structures at the level of phagosomes. Phagocytosis experiments were carried out on polystyrene beads and Zymosan, opsonized by IgG (phagocytosis FcR) or not. During FcR phagocytosis, punctiform actin structures appear at the level of phagocytic cups and closed phagosomes. Characterization by fluorescence super-resolution microscopy of these actin dots revealed a structure similar to that of podosomes in terms of size, lifespan and protein composition. We have named them PAPs, standing for Phagosome-Associated Podosomes. The presence of PAPs is correlated with the maturation of phagosomes into phagolysosomes. The second part describes a novel method for studying the molecular mechanisms involved in the generation of forces exerted by macrophages during phagocytosis. Prior to this work, such mechanisms were insufficiently documented, mainly due to a lack of a simple method for evaluating these forces on a large number of living cells. The method hereby presented combines measurements of compression and traction forces, and consists in analysing the forces applied by human macrophages phagocyting polyacrylamide micropillars of controlled size and rigidity. Using an automated procedure, the variations in radii and displacements of the pillars during phagocytosis are measured with nanometric precision. Finite element-based mechanical simulations were used to estimate the magnitude and direction of the compressive and tensile forces generated The results issued from these simulations support that actomyosin contractility is responsible for pillar contraction. Finally, this model of frustrated phagocytosis, allows to analyse the dynamics of the forces generated over several hours and on a large number of cells, revealing that traction and compression forces are not necessarily coupled and that the pillar strain energy decreases with the number of phagocytosis events, suggesting that macrophages are more efficient at phagocytizing one particle at a time. To conclude, this work has investigated the presence of podosomes at the level of closed phagosomes in Fcɣ - mediated phagocytosis, and their correlation with phagosome maturation. It also proposes a simple method to screen molecular actors for studying the forces generated during phagocytosis.