Régulation de la voie de signalisation ERK-MAPK par la GTPase RHOB dans un modèle cellulaire de cancer bronchique non à petite cellule.

Regulation of the ERK-MAPK signaling by the small GTPase RHOB in a cell model of non-small cell lung cancer

• Auteur / Autrice : Sebastian Castillo Faccio
• Direction : Stéphanie Cabantous, Jean-Denis Pedelacq
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie
• Date : Soutenance le 09/10/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Favre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Santamaria
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nicolas Bourmeyster, Jacqueline Cherfils, Xosé Bustelo

Mots clés

Mots clés contrôlés

GTPases

Inhibiteurs des tyrosine kinases

Thérapeutique

Poumon -- Cancer non à petites cellules

Mots clés libres

Signalisation

GTPase

Cancer bronchique

RHOB

Split-GFP

Mapk

Signaling

GTPase

Lung cancer

RHOB

Split-GFP

Mapk

Résumé

Les cancers bronchiques représentent la première cause de décès par cancer dans le monde. Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) sont les plus fréquents (85%) et 15 à 20% des patients présentent une mutation oncogénique sur le gène codant pour le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR). Ces mutations induisent l’activation constitutive du récepteur suivie d’une activation soutenue des voies de survie et de prolifération cellulaire indépendamment des signaux extracellulaires. Ainsi, l’activation anormale de ces voies participe au développement des cellules cancéreuses et à la progression de la maladie. A l’heure actuelle, les patients bénéficient de thérapies ciblées utilisant des inhibiteurs de tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR-TKi) qui ont considérablement amélioré la prise en charge de la maladie. Cependant, malgré leur efficacité, ces traitements se heurtent inévitablement à l’apparition de résistances responsables de la rechute. Notre laboratoire s’intéresse à l’étude de la GTPase RHOB dont l’expression diminue fréquemment au cours de l’évolution de la maladie. De plus, l’expression de RHOB s’oppose à la prolifération de cellules cancéreuses et favorise l’induction de l’apoptose. Paradoxalement, RHOB joue un rôle dans la résistance aux EGFR-TKi dans les CBNPC en favorisant la survie de ces cellules. Ainsi, il apparaît nécessaire d’étudier le rôle de RHOB dans le contrôle de la survie et de la prolifération cellulaire afin mieux comprendre ce paradoxe. Comme la plupart des GTPases, l’activité de RHOB est modulée par sa liaison aux nucléotides guanosine diphosphate (GDP) ou triphosphate (GTP). Lorsque RHOB est activé, il interagit avec des effecteurs pour transmettre des signaux cellulaires et aboutir à une fonction biologique. RHOB est également régulé par sa localisation subcellulaire qui se situe au niveau des membranes vésiculaires ainsi qu’à la membrane plasmique, où il interagit avec différents régulateurs et effecteurs. La régulation spatiotemporelle de RHOB est donc déterminante pour ses fonctions biologiques. Au travers de ce travail, nous avons mis au point une méthode de détection, à l’aide du biosenseur split-GFP tripartite, permettant la localisation spécifique de la forme active de RHOB dans des cellules fibroblastiques avec un niveau de résolution spatiale élevé. Ceci nous a notamment permis de mettre en évidence l’activation de RHOB au niveau des endosomes ainsi que le recrutement de sa forme active à la membrane plasmique suite à une stimulation par le sérum. De plus, nous avons également pu visualiser la localisation de complexes GTPases/effecteur. Ainsi, cette approche permet de visualiser des complexes de signalisation dans des compartiments cellulaires spécifiques et sera transposable à l’étude d’autres complexes protéiques. D’autre part, nous avons utilisé le biosenseur split-GFP pour la réalisation d’un crible d’interactions protéine-protéine afin d’identifier de nouveaux partenaires de RHOB dans un modèle de cellules de CBNPC muté EGFR. Nous avons ainsi mis en évidence que RHOB interagit avec les kinases MEK et ERK de la voie MAPK, qui joue un rôle clé dans la tumorigenèse, et inhibe l’activité de ERK probablement via l’implication d’une phosphatase. Ceci s’accompagne d’un arrêt du cycle cellulaire et de l’induction de l’apoptose. Nos résultats suggèrent que ces interactions participent au rôle de RHOB dans la suppression tumorale. À l’inverse, nous avons montré que ces interactions protectrices sont perdues suite à l’inhibition de l’EGFR et de la voie MAPK. Cela pourrait donc constituer un mécanisme par lequel ces traitements altèrent les fonctions de RHOB dans la suppression tumorale, ce qui expliquerait en partie ce paradoxe. Nous avons également utilisé le split-GFP pour isoler ces complexes et définir les réseaux d’interactions par spectrométrie de masse notamment dans le but d’identifier des phosphatases et régulateurs pouvant être impliquées dans le mécanisme.

Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide. Non-small cell lung cancers (NSCLC) are the most frequent form of lung cancer (85%) and 15 to 20% of patients have an oncogenic mutation in the gene coding for the epidermal growth factor receptor (EGFR). These mutations induce the constitutive activation of the receptor followed by sustained activation of cell survival and cell proliferation signaling pathways independently of extracellular signals. Thus, abnormal activation of these pathways participates in the development of cancer cells and the progression of the disease. Currently, these patients benefit from targeted therapies based on EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKi) which have greatly improved the outcome of the patients. However, despite their efficiency, these treatments are limited by the development of drug resistance and all the patients invariably relapse. Our laboratory is involved in the study of RHOB GTPase whose expression is frequently downregulated in NSCLC through the progression of the disease. Moreover, overexpression of RHOB impairs the proliferation of cancer cells and promotes apoptosis. Paradoxically, RHOB plays a role in the resistance to EGFR-TKi in NSCLC by promoting cell survival. Thus, it appears necessary to study the role of RHOB in the regulation of cell survival and cell proliferation to better understand this paradox. Like most GTPases, the activity of RHOB is regulated by binding to guanosine diphosphate (GDP) or triphosphate (GTP) nucleotides. Active RHOB (GTP-bound) interacts with downstream effectors to transmit cellular signals and mediate a biological function. RHOB is also regulated by its subcellular localization that could be at the vesicular membranes and at the plasma membrane where it interacts with different regulators and effectors. The spatiotemporal regulation of RHOB is therefore a crucial parameter determining its biological functions. Through this work, we have improved a detection method, based on the tripartite split-GFP biosensor, which allows the specific localization of the active form of RHOB in fibroblast cells with a high spatial resolution. Our results revealed the activation of RHOB at the endosomes followed by the recruitment of the activated form of RHOB towards the plasma membrane upon serum stimulation. In addition, we were also able to visualize the subcellular localization of GTPases/effector complexes. Thus, this biosensor allows the visualization of signaling protein complexes at specific cellular compartments and this can be transposed to the detection of other protein complexes. On the other hand, we used the split-GFP biosensor to perform a protein-protein interaction screening for the identification of new RHOB partners in a cell model of EGFR-mutated NSCLC. This highlighted novel interactions with MEK and ERK protein kinases, from the MAPK signaling pathway, which play a pivotal role in tumorigenesis. We showed that the active form of RHOB interacts with these kinases and inhibits the activity of ERK, probably via the involvement of a protein phosphatase. Expression of RHOB is also accompanied by induction of cell cycle arrest and apoptosis. Our results suggest that these interactions participate in the tumor suppressing functions of RHOB. Conversely, we have shown that these protective interactions are disrupted following inhibition of the EGFR or inhibition of the MAPK pathway. Therefore, this may be a mechanism by which targeted therapies alter the tumor suppressing functions of RHOB and could partially explain the paradox of RHOB. We also used the split-GFP to specifically isolate these protein complexes through anti-GFP pulldown and define the interaction networks by mass spectrometry, in particular, with the aim of identifying protein phosphatases and regulatory proteins that participate in RHOB-mediated ERK inhibition.