Identification de la distribution des cassures double-brin endogènes et étude de la dynamique de l'accessibilité de la chromatine au cours de la réparation par des approches de génomique à haute résolution

Using high resolution genomics to identify endogenous DSB hotspots and investigate chromatin accessibility dynamics during DSB repair

• Auteur / Autrice : Sarah Collins
• Direction : Gaëlle Legube, Thomas Clouaire
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Bio-informatique, génomique et biologie des systèmes
• Date : Soutenance le 11/12/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de biologie moléculaire, cellulaire et du développement (Toulouse ; 2021-....)
• Jury : Président / Présidente : Kerstin Bystricky
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nicola Crosetto, Vera Pancaldi
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Daniel Jost, Corinne Grey, Chunlong Chen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épigénétique

Chromatine

Cassures double-brin de l'ADN

Mots clés libres

Modifications de la chromatine

Réparation du DSB

Informations épigénétiques

Chromatin Modifications

DSB repair

Epigenetic information

Résumé

Les cassures double brin de l'ADN (DSB) sont les lésions de l'ADN les plus délétères et de nombreuses maladies humaines sont associées à des défauts de réparation des DSB. Dans les cellules, l'ADN est organisé en chromatine, qui régule étroitement son accessibilité et impacte donc tous les aspects du métabolisme de l'ADN, y compris la réparation du DSB. Au cours de mon doctorat, j'ai étudié le mécanisme de réparation des cassures double brin de l'ADN à l'aide de technologies de séquençage de nouvelle génération et d'analyses bioinformatiques. Dans un premier projet, je me suis concentré sur la compréhension de la biogenèse des DSB endogènes, issus de processus cellulaires qui peuvent être source d'instabilité génomique, notamment des réarrangements chromosomiques à grande échelle conduisant à la carcinogenèse. J'ai caractérisé les DSB endogènes détectés par cartographie ChIP-seq d'ATM phosphorylés dans des cellules humaines et de souris et analysé leur distribution dans le génome. J'ai découvert qu'un grand sous-ensemble de ces DSB se trouvent dans des régions amplificatrices. Fait intéressant, j'ai pu identifier que ces '' DSB amplificateurs '' sont enrichis en ADN-Z, une structure secondaire d'ADN non-B. Je présente également la preuve que ce sous-ensemble de ''DSB activateurs'' endogènes est associé à une augmentation des contacts activateur-promoteur, probablement par l'extrusion de boucles médiée par la cohésine. Globalement, mes résultats suggèrent que les DSB endogènes au niveau des activateurs pourraient participer à la régulation de l'expression du gène associé. Dans un deuxième projet, j'ai étudié comment la structure de la chromatine est modifiée suite aux DSB afin de faciliter le recrutement de facteurs de réparation spécifiques des DSB lors de la réponse aux dommages de l'ADN (DDR). Pour cela, j'ai utilisé des méthodes de séquençage de nouvelle génération haute résolution (telles que ChIP-seq et ATAC-seq) dans un modèle cellulaire humain permettant d'induire plusieurs DSB spécifiques à des séquences. J'ai observé que l'accessibilité de la chromatine est augmentée à proximité du DSB. Cette accessibilité accrue chevauche les profils de liaison des protéines de liaison à l'ADN simple brin RPA et RAD51 et dépend de CtIP et du complexe MRN, suggérant un lien entre la résection terminale et l'accessibilité de la chromatine. En utilisant ATAC-seq unicellulaire, j'ai pu résoudre l'accessibilité de la chromatine induite par le DSB tout au long du cycle cellulaire et déconvoluer l'hétérogénéité de l'accessibilité de la chromatine (et potentiellement mettre fin à la résection) au niveau des DSB individuels dans des cellules uniques. Globalement, mes résultats suggèrent que le remodelage de la structure de la chromatine joue un rôle important dans le traitement et la réparation des extrémités du DSB.

DNA Double-Strand Breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions and many human diseases are associated with DSB repair defects. In cells, DNA is organized into chromatin, which tightly regulates its accessibility and therefore impacts all aspects of DNA metabolism, including DSB repair. During my PhD, I have studied the mechanism of DNA double-strand break repair using next generation sequencing technologies and bioinformatics analysis. In a first project, I have focused on understanding the biogenesis of endogenous DSBs, arising from cellular processes which can be a source of genomic instability including large scale chromosomal rearrangements leading to carcinogenesis. I have characterized endogenous DSBs detected by ChIP-seq mapping of phosphorylated ATM in human and mouse cells and analysed their distribution throughout the genome. I found that a large subset of these DSBs lie within enhancer regions. Interestingly, I could identify that these ''enhancer DSBs'' are enriched for Z-DNA, a non-B DNA secondary structure. I also present evidence that this subset of endogenous ''enhancer DSBs'' are associated with increased enhancer-promoter contacts, probably through cohesin-mediated loop extrusion. Altogether, my results suggests that endogenous DSBs at enhancers could participate in regulating the expression of the associated gene. In an second project, I have investigated how chromatin structure is modified following DSBs in order to facilitate the recruitment of specific DSB repair factors during the DNA Damage Response (DDR). For this, I have used high resolution next-generation sequencing methods (such as ChIP-seq and ATAC-seq) in a human cellular model allowing to induce multiple sequence-specific DSBs. I have observed that chromatin accessibility is increased at the vicinity of DSB. This increased in accessibility overlaps with the binding profiles for the single-strand DNA binding proteins RPA and RAD51 and depends on CtIP and the MRN complex, suggesting a link between end resection and chromatin accessibility. Using single-cell ATAC-seq, I was able to resolve DSB-induced chromatin accessibility across the cell cycle and to deconvolute the heterogeneity in chromatin accessibility (and potentially end resection) at the level of individual DSBs in single cells. Altogether, my results suggest that the remodelling of chromatin structure plays an important role in DSB end processing and repair.