Apport de la cryo-holographie en microscopie électronique pour l'étude des matériaux biologiques

Contribution of Cryo-Holography in electron microscopy for the study of biological materials

• Auteur / Autrice : Elio Karim
• Direction : Etienne Snoeck, Pierre-Emmanuel Gleizes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie, Biologie, Santé
• Date : Soutenance le 15/12/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Matière (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'élaboration de matériaux et d'études structurales (Toulouse ; 1988-....)
• Jury : Président / Présidente : Anne-Marie Gué
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sergio Marco
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Angus Kirkland, Daniel Lévy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Échantillons biologiques

Cryomicroscopie électronique

Holographie

Mots clés libres

Cryo-holographie

Holographie électronique

Microscopie électronique

Images de phases

Cryo-holography

Electron microscopy

Electronic holography

Phase Images

Résumé

Cette thèse présente une évaluation des capacités de l'imagerie de phase par holographie électronique pour l'observation d'échantillons biologiques, en couplant les méthodologies les plus avancées dans ce domaine et la cryomicroscopie électronique qui permet l'observation des échantillons dans un état quasi-natif. Nous avons étudié les possibilités de l'holographie "off-axis" et l'holographie "in-line" à température ambiante et en condition cryogénique. La préparation des échantillons et les conditions expérimentales en MET ont été optimisées en mettant l'accent sur la mise en œuvre d'un protocole à faible dose d'électrons. Des observations ont alors été réalisées sur le microscope I2TEM au CEMES, dédié à l'holographie off-axis, en utilisant les bactériophages T4 et T5 comme échantillons test. La résolution a atteint 4 nm à température ambiante. En mode cryogénique, la structure des bactériophages a été observée de façon plus détaillée, mais nous avons rencontré des limitations importantes, notamment l'augmentation du bruit à de faibles doses d'électrons et l'instabilité thermique du porte-échantillon. L'holographie en ligne en mode cryogénique a en revanche permis d'obtenir des images contrastées et bien résolues des phages, et montré la possibilité d'accéder à la charge de l'échantillon, ici la charge de la capside des phages qui joue un rôle important dans leur assemblage. Pour compléter ces données, nous avons également exploré la combinaison des deux méthodes d'holographie, qui offrent des performances complémentaires dans les basses et hautes fréquences spatiales. Nous présentons aussi des résultats préliminaires sur la visualisation des phages par ptychographie électronique, une autre méthode d'imagerie de phase. Ce travail exploratoire et interdisciplinaire met en lumière les possibilités originales offerte par l'holographie électronique pour l'imagerie biologique, et identifie les barrières à lever pour rendre ces approches plus opérationnelles.

The goal of this thesis was to assess the capabilities of phase imaging by electron holography for the observation of biological samples, by coupling the most advanced methodologies in this field with cryo-electron microscopy, which enables samples to be observed in a quasi-native state. We explored the capabilities of off-axis and in-line holography, at room temperature and in cryogenic conditions. Sample preparation and TEM experimental conditions were optimized, with particular emphasis on the implementation of a low-dose electron protocol. Observations were then made on the I2TEM microscope at CEMES, a microscope dedicated to off-axis holography, using T4 and T5 bacteriophages as test samples. At room temperature, we could achieve the medium resolution of 4 nm. In cryogenic mode, the structure of bacteriophages was observed in greater detail, but we encountered significant limitations, including increased noise at low electron doses and thermal instability of the sample holder. In-line holography in cryogenic mode, on the other hand, enabled us to obtain contrasted, well-resolved images of the phages, and showed the possibility of assessing the charge of the sample, in this case the charge of the phage capsid, which plays an important role in their assembly. To complement these data, we also explored the combination of the two holography methods, which offer complementary performance at high and low spatial frequencies, and we present preliminary results on phage visualization using electron ptychography, another phase imaging method. This exploratory and interdisciplinary thesis highlights the original possibilities offered by electron holography for biological imaging, and identifies the barriers to be overcome to make these approaches more operational.