Etude des mécanismes moléculaires du contrôle de la traduction en réponse au stress dans des cellules cardiaques et endothéliales lymphatiques

Study of the molecular mechanisms of translational control in response to stress in cardiac and lymphatic endothelial cells

• Auteur / Autrice : Emilie Roussel
• Direction : Anne-Catherine Prats, Barbara Garmy-Susini
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique moléculaire
• Date : Soutenance le 23/11/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (Toulouse ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Emmanuel Gleizes
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Catez
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pascale Romby, Pierre Close

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteurs de croissance

ARN non codants

Site d'entrée interne des ribosomes

Mots clés libres

Facteurs de croissance

ARN non codant

Ribosome

IRES

ITAF

Traduction

Growth factors

Non coding RNA

Ribosome

IRES

ITAF

Translation

Résumé

L'angiogenèse et la lymphangiogenèse jouent un rôle majeur dans le développement et l'aggravation de nombreuses pathologies. Elles sont induites en réponse à l'hypoxie tumorale et favorisent la dissémination métastatique. Les traitements anticancéreux peuvent quant à eux engendrer une dysfonction lymphatique. Ces deux processus sont au contraire bénéfiques dans l'ischémie du myocarde où ils contribuent à restaurer l'apport sanguin et à diminuer l'inflammation. La formation de nouveaux vaisseaux est gouvernée par l'action de facteurs de croissance des familles VEGFC (Vascular Endothelial Growth Factors) et FGF (Fibroblast Growth Factor). L'expression de ces facteurs de croissance est régulée au niveau traductionnel en réponse à différents stress par des structures de leur ARNm, les IRES (Internal Ribosome Entry Sites) qui leur permettent de continuer à être traduits malgré le blocage exercé sur la traduction dépendante de la coiffe. L'activité des IRES est contrôlée par des facteurs appelés ITAF (IRES trans-acting factors).Dans le premier volet de ces travaux, nous avons étudié le rôle des paraspeckles et du long ARN non codant Neat1 dans la régulation de la traduction IRES-dépendante en réponse au stress hypoxique dans des cardiomyocytes murins HL1. Les paraspeckles sont des corps nucléaires qui se forment en réponse au stress hypoxique. Ces corps se compose de nombreuses protéines qui s'articulent autour du long ARN Neat1 qui en forme le squelette. Plusieurs protéines qui le composent ont été identifiées comme ITAF, suggérant un rôle du paraspeckle dans la traduction IRES-dépendante. Par des expériences de déplétion, nous avons identifié Neat1 comme un régulateur clé de l'activité des IRES des ARNm des facteurs de croissance angiogéniques et lymphangiogéniques alors que deux protéines du paraspeckle, p54nrb et PSPC1, régulent des sous-groupes d'IRES. L'interactome de P54nrb étudié par spectrométire de masse a permis d'identifier deux autres ITAF : La protéine ribosomique RPS2 et la nucléoline. Nous avons montré par hybridation in situ que Neat1 et l'ARNm portant l'IRES du FGF1 interagissent en condition d'hypoxie suggérant un recrutement des ARNm portant un IRES par le paraspeckle. Ces nouveaux résultats nous ont amenés à l'hypothèse que les paraspeckles sont une plateforme d'assemblage de l'IREsome. Ce complexe ribonucléoprotéique se formerait dans le noyau et serait ensuite exporté dans le cytoplasme pour permettre la traduction IRES-dépendante. Dans le second volet de mes travaux, je me suis focalisée sur l'identification de ribosomes spécialisés responsables de la traduction IRES-dépendante lors du stress. Le modèle choisi est la cellule endothéliale lymphatique, située au cœur des processus de lymphangiogenèse physiologique et pathologique. Nous avons montré que les IRES des ARNm du VEGFC et FGF1 sont activés en réponse au stress du réticulum endoplasmique, et au stress génotoxique provoqué par un agent de chimiothérapie anticancéreuse, la doxorubicine. Nous avons analysé la composition des polysomes de cellules endothéliales soumises à ces stress en spectrométrie de masse, et montré que cette composition varie différentiellement pour ces deux stress. La protéine RPL13A est plus abondante dans les polysomes lors du stress du RE, alors que la RPL26 augmente dans les polysomes de cellules traitées doxorubicine. D'autre part nous avons réalisé des expériences de RiboMethSeq qui ont permis d'identifier plusieurs sites de méthylation des ARN ribosomiques issus des polysomes, qui sont eux aussi impactés différentiellement par les deux stress. L'impact de RPL13A et RPL26 ainsi que des méthylations de l'ARNr sur la traduction IRES-dépendante est actuellement en cours d'étude.

Angiogenesis and lymphangiogenesis play a major role in the development and aggravation of several pathologies. They are induced in response to tumor hypoxia and promote metastatic dissemination. Lymphatic dysfunction can result from cancer treatments. However, both processes are beneficial in myocardial ischemia, where they help to restore blood flux and reduce inflammation. New vessel formation is governed by the action of growth factors of the vascular endothelial growth factors (VEGF) and FGF (Fibroblast Growth Factor) families. Expression of these growth factors is regulated at the translational level in response to various stresses by mRNA structures, internal ribosome entry sites (IRESs), which enable them to continue to be translated despite the blockade of cap-dependent translation. IRES activity is controlled by IRES trans-acting factors (ITAFs). In the first part of this work, we investigated the role of paraspeckles and of the long non-coding RNA Neat1 in the regulation of IRES-dependent translation in HL-1 murine cardiomyocytes submitted to hypoxic stress. Paraspeckles are nuclear bodies formed in response to hypoxia. These bodies are composed of several proteins that are articulated around the long Neat1 RNA that forms their skeleton. Several paraspeckle proteins have been identified as ITAFs, suggesting a role for paraspeckle in IRES-dependent translation. Using depletion experiments, we have identified Neat1 as a key regulator of the IRES activity of angiogenic and lymphangiogenic growth factor mRNAs, while two paraspeckle proteins, p54nrb and PSPC1, regulate IRES subgroups. The P54nrb interactome studied by mass spectrometry has led us to identification of two other ITAFs: the ribosomal protein RPS2 and nucleolin. We have showed by in situ hybridization that Neat1 and the mRNA carrying the FGF1 IRES interact under hypoxic conditions, suggesting the recruitment of IRES-containing mRNAs into paraspeckle. These new results led us to hypothesize that paraspeckles are a platform for IREsome assembly. This ribonucleoprotein complex would be formed in the nucleus and then exported to the cytoplasm to enable IRES-dependent translation. In the second part of my work, I focused on the identification of specialized ribosomes responsible for IRES-dependent translation during stress. The chosen model has been the lymphatic endothelial cell, as the core of physiological and pathological lymphangiogenesis processes. We have shown that the IRESs of VEGFC and FGF1 mRNAs are activated in response to endoplasmic reticulum stress, and to genotoxic stress induced by an anticancer chemotherapy agent, doxorubicin. We analyzed the composition of polysomes from endothelial cells subjected to these stresses by mass spectrometry, and have shown that ribosome composition varies differentially for these two stresses. RPL13A protein is more abundant in polysomes under ER stress, while RPL26 increases in polysomes from doxorubicin-treated cells. RiboMethSeq experiments have allowed us to identify several methylation sites in polysome-derived ribosomal RNAs, which are also differentially impacted by the two stresses. The impact of RPL13A and RPL26 as well as of rRNA methylations on IRES-dependent translation is currently under investigation.