Fonction de la chymotrypsine dans l'homéostasie de la barrière intestinale

Function of chymotrypsin in gut barrier homeostasis

• Auteur / Autrice : Simon Guignard
• Direction : Céline Deraison-Manuel, Chrystelle Bonnart
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiopathologie
• Date : Soutenance le 23/10/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de recherche en santé digestive (Toulouse ; 2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Nicolas Cenac
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Maude Le Gall
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Jay, Alain Couvineau, Ralf Jockers

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épithélium intestinal

Récepteurs activés par les protéases

Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin

Mots clés libres

Épithélium intestinal

Protéases

Chymotrypsine

Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI)

Récepteurs activés par les protéases (PARs)

Signalisation

Intestinal epithelium

Proteases

Chymotrypsin

Inflammatory Bowel Disease (IBD)

Protease-Activated Receptors (PARs)

Signalling

Résumé

L'épithélium intestinal est exposé à un grand nombre d'enzymes protéolytiques pouvant provenir des sécrétions pancréatiques, du microbiote ou de la muqueuse de l'hôte. Plus que de simples enzymes cataboliques, les protéases jouent un rôle clé dans le maintien de l'homéostasie intestinale en assurant des fonctions très variées. Certaines d'entre elles sont notamment capables d'activer une famille de récepteurs membranaires : les Récepteurs Activés par les Protéases (PARs), qui comprennent 4 membres (PAR1-4). Ils sont exprimés par de nombreux types cellulaires dans l'intestin, y compris les cellules épithéliales, et ont des effets pléiotropes. Une connaissance fine des acteurs de la signalisation protéolytique est donc un enjeu majeur pour mieux comprendre la physiologie intestinale. Les travaux conduits au cours de cette thèse se sont attachés à caractériser le rôle de la chymotrypsine, une protéase pancréatique essentiellement connue pour son rôle digestif, dans l'homéostasie intestinale. Abondamment déversée dans la lumière intestinale, nous avons pu montrer que la chymotrypsine était retrouvée sous sa forme active à proximité de la muqueuse intestinale. Nous avons ensuite caractérisé les effets potentiels de cette protéase sur l'épithélium intestinal, notamment via l'activation des récepteurs PARs. Par des approches pharmacologiques, nous avons mis en évidence que cette enzyme était capable de cliver les récepteurs PAR1 et PAR2, tous deux exprimés par les cellules épithéliales intestinales. Dans des lignées cellulaires, mes travaux ont montré que cette enzyme activait le récepteur PAR2, induisant l'activation d'une signalisation calcique et MAPK intracellulaire. En revanche, elle désarme PAR1, prévenant ainsi son activation par son agoniste canonique, la thrombine. Nous avons ensuite étudié les effets fonctionnels de la chymotrypsine sur l'épithélium intestinal in vitro. Le traitement d'organoïdes coliques humains avec de la chymotrypsine promeut l'expression de gènes importants pour le maintien de l'homéostasie épithéliale (IL10, MUC2, LGR5, CHGA), sans modifier l'expression de facteurs pro-inflammatoires. Ceci suggère un effet protecteur de cette enzyme vis-à-vis de l'épithélium intestinal. De plus, l'induction de l'expression d'IL10 par la chymotrypsine semble dépendante du récepteur PAR2, indiquant des effets fonctionnels de l'axe chymotrypsine-PAR2. En outre, plusieurs études indiquent que la suractivation de certaines protéases contribue à la physiopathologie des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin (MICI). Nous avons donc exploré la régulation de cette enzyme en contexte d'inflammation intestinale. Dans une cohorte humaine, nous avons observé que l'activité chymotrypsique fécale était significativement augmentée chez des patients atteints de MICI, comparée à des donneurs sains. Cette augmentation était spécifiquement retrouvée chez des patients dont la maladie était cliniquement active. Ces investigations préliminaires ouvrent la voie à des études plus poussées permettant d'explorer précisément le rôle de cette protéase en condition pathologique. En parallèle, nous avons également recherché une potentielle expression extra-pancréatique de la chymotrypsine, par la muqueuse digestive. Chez L'Homme et la souris, nos analyses ont montré que certaines formes de chymotrypsine étaient détectées dans l'épithélium intestinal mais aussi gastrique, ouvrant de nouvelles perspectives sur les fonctions de cette enzyme au sein de ces tissus. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis d'identifier la chymotrypsine comme un nouvel acteur de la signalisation protéolytique dans le tractus digestif dont les fonctions vont bien au-delà de ses seules implications digestives. Additionnés à la littérature existante, nos résultats apportent un nouvel éclairage sur l'importance des protéases luminales dans les interactions complexes qui régissent l'homéostasie intestinale.

In the gut, the epithelium is constantly exposed to a wide variety of proteolytic enzymes originating from the microbiota, host mucosa or host secretion products, including the pancreatic juice. More than simple catabolic enzymes, proteases play a key role for digestive health, ensuring many physiological functions. Some proteases are able to act as true signaling mediators by activating a family of cell surface receptors called Protease-Activated Receptors (PARs). This family includes 4 members (PAR1-4) whose activation has pleiotropic effects and which are expressed by many cell types in the gut, including epithelial cells. In this context, a complete identification of the actors involved in proteolytic signaling is therefore a major issue to better understand the intestinal physiology. The work presented in this manuscript aimed to characterize the function of chymotrypsin in intestinal homeostasis. This enzyme is a pancreatic protease essentially known to be involved in food digestion. Being abundantly secreted into the intestinal lumen, our work showed that active chymotrypsin was also detectable in the vicinity of the murine and human intestinal mucosa. We then characterized the potential effects of chymotrypsin on the intestinal epithelium, especially via a possible activation of PARs. Our pharmacological studies evidenced that this enzyme was able to cleave the PAR1 and PAR2 receptors, both expressed by intestinal epithelial cells. In addition, we identified that chymotrypsin is able to activate calcium and ERK1/2 signaling pathways through PAR2, in intestinal epithelial cell lines. Conversely, our results show that chymotrypsin disarms PAR1, hereby preventing further activation of the receptor by its canonical agonist thrombin. We then addressed the functional effects of chymotrypsin on intestinal epithelial cells in vitro. Treatment of human colonic organoids with chymotrypsin promoted the expression of several factors (IL10, MUC2, LGR5, CHGA) involved in the protection and maintenance of the epithelial barrier function, without affecting pro-inflammatory markers. This suggests that chymotrypsin could exert protective effects on the intestinal epithelium. Moreover, the induction of IL10 by chymotrypsin appears to be dependent on the PAR2 receptor, indicating functional effects of the chymotrypsin-PAR2 axis. In the past, several studies reported the involvement of proteolytic overactivity in the pathophysiology of Inflammatory Bowel Diseases (IBD). Hence, we explored the regulation of chymotrypsin in the context of intestinal inflammation. In a human cohort, we observed that fecal chymotrypsin activity was significantly increased in IBD patients compared to healthy donors. This increase was specifically found in patients with clinically active disease. These preliminary results pave the way for further studies examining in detail the role of this protease in pathological contexts. Furthermore, we also investigated a potential extra-pancreatic expression of chymotrypsin, by the digestive mucosa. In both human and murine tissues, we found that several forms of chymotrypsin were detected in the intestinal epithelium but also in the stomach, opening new perspectives on the functions of this enzyme within these tissues. In conclusion, our work allowed to identify chymotrypsin as a new regulator of proteolytic signalling in the GI tract, whose functions go well beyond its digestive implications. Added to the existing literature, our results shed new light on the importance of luminal proteases in the complex interactions that govern intestinal homeostasis.