Caractérisation des exopolymères de granules aérobies épuratifs : vers leur valorisation en tant que matériaux biosourcés issus du traitement des eaux usées

Characterization of exopolymers from aerobic granules : towards their valorization as bio-sourced materials issued from the treatment of effluents

• Auteur / Autrice : Abdo Bou Sarkis
• Direction : Elisabeth Girbal, Yolaine Bessière
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 01/06/2023
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biotechnologies Agroalimentaire et Environnementale (Toulouse ; 2011-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Elisabeth Girbal, Yolaine Bessière, Sylvia Colliec-Jouault, Susana De Matos Fernandes, Jérôme Hamelin, Etienne Paul
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvia Colliec-Jouault, Susana De Matos Fernandes

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biopolymères

Eaux usées -- Épuration -- Traitement biologique

Bactéries aérobies

Mots clés libres

Granules aérobies épuratifs

Substances extracellulaires polymériques

Extraction

Biopolymères

Test de gélification

Valorisation

Aerobic granular sludge

Extracellular polymeric substances

Extraction

Biopolymers

Gelation screening method

Valorization

Résumé

Les granules aérobies épuratifs sont des biofilms sphériques et denses, composés de bactéries entourées par une matrice de substances extracellulaires polymériques (EPS). L'utilisation de ces biofilms pour le traitement des eaux usées est en plein essor en raison de leur efficacité à traiter les polluants tout en étant plus compacts et moins consommateurs en énergie que les procédés à boues activées. Leur valorisation à travers l'extraction de différents sous-produits à haute valeur ajoutée représente un enjeu économique et sociétal pour les années à venir. La production de biopolymères gélifiants récupérés à partir des EPS de la matrice granulaire est une voie prometteuse qui a été étudiée dans ce travail de thèse. Les EPS sont biochimiquement très diversifiés car composés d'un mélange de polysaccharides, de protéines, de lipides, d'acides humiques et d'ADN. Ils jouent un rôle important dans la structuration du biofilm granulaire et contribuent de façon essentielle au caractère dense et très cohésif de la matrice extracellulaire. De ce fait, la méthode d'extraction des EPS gélifiants qui a été adoptée repose sur une solubilisation alcaline à température élevée suivie d'une étape de précipitation acide. Les effets des solvants et des températures de chauffage sur la récupération et les propriétés des EPS gélifiants ont été étudiés. L'hydroxyde de sodium a permis une meilleure solubilisation des EPS par rapport au carbonate de sodium (respectivement 711,3 ± 38,0 et 408,4 ± 4,0 mg/g) mais la capacité à précipiter les EPS gélifiant à pH acide était plus élevée dans le carbonate de sodium (22 % contre 6 % dans de la soude à 80 °C). L'augmentation de la température de 20 °C à 80 °C a permis un meilleur rendement de solubilisation des EPS mais la dégradation des polymères dans l'hydroxyde de sodium a été mise en évidence, ce qui a orienté le choix vers le carbonate de sodium (0,2 M, 1h à 80 °C). Diverses stratégies expérimentales ont ensuite été développées (i) une méthode miniaturisée capable de détecter la gélification induite par le calcium et (ii) le fractionnement des molécules extraites par voie alcaline et précipitation acide. La méthode miniaturisée utilisant seulement 1 à 3 mg d'échantillon pour évaluer la capacité de gélification a été mise au point sur des molécules modèles pures ou en mélange, telles que l'alginate, l'albumine de sérum bovin et l'ADN. La méthode a consisté à calculer un pourcentage de réactivité (%R) à travers les spectres UV-vis et à déterminer le pourcentage de volume de gel (%Vg) formé après l'ajout de calcium. Les deux facteurs ont été combinés pour donner un facteur de gélification (GF) permettant de classer les solutions selon leur capacité de gélification. Les EPS extraits par voie alcaline et précipitation acide ont été fractionnés en fonction de leur charge à l'aide d'une colonne de chromatographie d'échange d'anions préparative. Le GF a été déterminé pour chaque fraction éluée et il a été montré que le GF des EPS anioniques adsorbés était corrélé avec leur charge négative. La distribution en taille des molécules présentes au sein des fractions et participant à la gélification a été analysée par chromatographie d'exclusion stérique : la majorité des hauts poids moléculaires détectés participent à la gélification alors que la participation des bas poids moléculaires est limitée. Enfin, il a été montré que même après fractionnement, les molécules anioniques participant à la gélification restent biochimiquement diversifiées et que les gels formés par les EPS isolés des granules sont des hydrogels fortement composites. Dans le but de valoriser les EPS gélifiants, les résultats obtenus soulignent la nécessité de moduler les méthodes d'extraction et de fractionnement vers la sélection de molécules ayant la charge négative appropriée et également vers la préservation de leur poids moléculaire lors des étapes d'extraction.

Aerobic granular sludges are dense spherical structured biofilms, composed of bacteria embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) used for treating wastewater. Their use for treating wastewater is booming due to their efficiency in terms of pollutants removal while being more compact and less energy consuming than activated sludge processes. Their valorization through the extraction of various added value by-products represents an economic and societal challenge for the years to come. The production of gel-forming biopolymers recovered from the EPS of the granular biofilm is a promising valorization route that has been studied in this thesis. EPS are biochemically very diverse as they are composed of a mixture of polysaccharides, proteins, lipids, humic acids and DNA. They play an important role in structuring the granular biofilm and contribute in an essential way to the dense and very cohesive nature of the extracellular matrix. Therefore, the extraction method of gel-forming EPS which has been developed relies on alkaline solubilization at high temperature followed by an acidic precipitation step. The effects of solvents and heating temperatures on the recovery and degradation of gel-forming EPS were determined. Sodium hydroxide allowed a better EPS solubilization compared to sodium carbonate (711.3 ± 38.0 and 408.4 ± 4.0 mg/g respectively) but the capacity to precipitate gel-forming EPS at acidic pH was higher in sodium carbonate (22% compared to 6% in sodium hydroxide at 80 °C). Increasing the temperature from 20 °C to 80 °C allowed a better solubilization of EPS but the degradation of polymers in sodium hydroxide was evidenced and therefore the choice of extraction conditions was oriented towards sodium carbonate 0.2 M, during 1h at 80 °C. Various experimental strategies were then developped (i) a miniaturized quick method capable of detecting gelation and (ii) the fractionation of the extracted molecules by alkaline and acidic precipitation. The miniaturized method (using only 1 to 3 mg of sample) for gelation capacity screening has been developed on pure or mixed model molecules, such as alginate, bovine serum albumin and DNA. The method consisted of calculating a percentage of reactivity (%R) through UV-vis spectra and determining the percentage of gel volume (%Vg) formed after the addition of calcium. Both factors were combined to give a gelling factor (GF) allowing the classification of solutions according to their gelation capacity. EPS extracted by alkaline and acid precipitation were fractionated according to their charge using a preparative anionic exchange chromatography column. The GF was determined for each eluted fraction and it was shown that the GF of the adsorbed anionic EPS correlated with their global negative charge. The size distribution of the molecules within the fractions and those participating in the gelation was analyzed by size exclusion chromatography: the majority of detected high molecular weights participate in gelation whereas low molecular weights' participation in gelation is limited. Therefore, the obtained results show that both charge and molecular size are important factors for gelation. Finally, it was shown that even after fractionation, the anionic molecules involved in gelation remain biochemically diversified and that the hydrogels formed with EPS isolated from granules are strongly composite hydrogels. With the goal of valorizing gel-forming EPS, the obtained results underline the necessity to modulate the extraction and purification methods towards the selection of molecules having the appropriate negative charge and also towards the preservation of their molecular weight during the extraction steps.