Adaptations à la déshalogénation et à l’utilisation du chlorométhane par la voie cmu chez Methylobacterium extorquens

Adaptations to dehalogenation and utilization of chloromethane by the cmu pathway in Methylobacterium extorquens

• Auteur / Autrice : Louis-François Mey
• Direction : Françoise Bringel, Stéphane Vuilleumier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaire et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 18/12/2023
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique moléculaire, génomique et microbiologie (Strasbourg)
• Jury : Président / Présidente : Valérie Geoffroy
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Volker Döring
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Claire Prigent-Combaret, Pierre Amato

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biodégradation

Chlorométhane

Déshalogénation

Bactéries méthylotrophes

Mots clés libres

Bactéries

Méthylotrophie

Déshalogénation

Chlorométhane

Évolution expérimentale

Adaptations métaboliques

Bacteria

Methylotrophy

Dehalogenation

Chloromethane

Experimental evolution

Metabolic adaptation

Résumé

Le chlorométhane (CH3Cl), un gaz organohalogéné principalement d’origine naturelle impliqué dans la dégradation de l’ozone dans l'atmosphère, est dégradé par des bactéries méthylotrophes capables d’utiliser des composés sans liaisons carbone-carbone tels que le méthanol comme seule source de carbone et d’énergie. Les Alpharotéobactéries méthylotrophes Methylobacterium extorquens CM4 et Hyphomicrobium sp. MC1 utilisent le CH3Cl par la voie cmu initiée par transfert du carbone de CH3Cl au tétrahydrofolate (H4F) catalysé par CmuA et CmuB. Le méthyl-H4F formé est ensuite dirigé vers la formation de biomasse ou oxydé en CO2 via le formiate. Cette voie, acquise par transfert horizontal, ne suffit pas à conférer la croissance à une souche réceptrice. Les adaptations aux stress inhérents à la croissance avec le CH3Cl sont peu connues.Afin d'identifier de telles adaptations chez M. extorquens, le plasmide pJM105 contenant les gènes cmu de Hyphomicrobium sp. MC1 a été transféré à deux souches de M. extorquens (AM1 et DM4) incapables de se développer avec le CH3Cl. Une approche d’évolution expérimentale sur 200 générations environ a permis d’améliorer la croissance de ces souches avec le CH3Cl. Le séquençage du génome de 13 des 162 souches évoluées obtenues a révélé 64 mutations (SNP, délétion ou insertion d’un nucléotide, larges délétions) dans 45 gènes, ainsi que d'autres évènements génétiques (réarrangement entre plasmides, grandes délétions). Des mutations inactivant le gène de la formyl-tétrahydrofolate ligase (FtfL) essentiel pour l’assimilation du carbone issu du méthanol ont été identifiées dans 8 des 13 souches séquencées. La construction et l'analyse de mutants de ce gène ont montré que l’inactivation de FtfL suffit à conférer la croissance avec la CH3Cl par la voie cmu à M. extorquens DM4. Je fais l’hypothèse que cette enzyme interfère avec l'oxydation du CH3Cl pour la production d'énergie tout en consommant le cofacteur H4F essentiel à ce métabolisme, et que son activité s'oppose à celle de l'enzyme homologue PurU requise pour la croissance avec le CH3Cl par la voie cmu. Parmi les autres mutations mises en évidence, une mutation dans le promoteur des gènes nuo pourrait faciliter l’expression de la NADH déshydrogénase impliquée dans la régénération du cofacteur NAD+. D'autres adaptations indépendantes de FtfL ont été détectées, qui diffèrent selon le contexte génétique de la souche receveuse des gènes de la voie cmu. Par exemple, les souches évoluées AM1 montrent toutes des mutations dans pJM105 (dans le gène cmuA, avec coïntégration d'un plasmide endogène). Ces mutations n’ont cependant pas d’impact sur l’activité de déshalogénation du CH3Cl dépendant de CmuA. L'obtention et la caractérisation de souches mutantes par évolution expérimentale au laboratoire représente un nouvel outil prometteur pour l’étude de la croissance avec le CH3Cl par la voie cmu, notamment du fait des difficultés rencontrées jusqu'ici dans les approches de mutagenèse dirigée des bactéries dégradant le CH3Cl.

Chloromethane (CH3Cl), a mainly naturally occurring organohalogen gas, is involved in ozone degradation in the atmosphere. CH3Cl is degraded by methylotrophic bacteria capable of using compounds without carbon-carbon bonds, such as methanol, as their sole source of carbon and energy. Two such methylotrophic Alphaproteobacteria, Methylobacterium extorquens CM4 and Hyphomicrobium sp. MC1, utilize CH3Cl via the cmu pathway initiated by carbon transfer from CH3Cl to tetrahydrofolate (H4F) catalyzed by CmuA and CmuB. Methyl-H4F formed is then used for biomass production or oxidized to CO2 via formate. The cmu pathway, often acquired by horizontal transfer, is not sufficient to confer growth to a recipient strain. However, little is known about the adaptations needed to overcome stresses inherent to growth with CH3Cl.To identify such adaptations in M. extorquens, the plasmid pJM105 containing the cmu genes from Hyphomicrobium sp. MC1 was transferred to two M. extorquens strains (AM1 and DM4) unable to grow with CH3Cl. An experimental evolution approach, spanning some 200 generations, was performed to improve strain growth with CH3Cl. Genome sequencing of 13 of the 162 evolved strains obtained revealed 64 mutations (SNPs, nucleotide deletions or insertions, large deletions) in 45 genes, as well as other genetic events (plasmid rearrangements, large deletions). Mutations inactivating the formyl-tetrahydrofolate ligase (FtfL) gene, essential for assimilation of carbon from methanol, were identified in 8 of the 13 sequenced strains. Construction and analysis of mutants of this gene showed that inactivation of FtfL was sufficient to confer growth with CH3Cl via the cmu pathway to M. extorquens DM4. I hypothesize that this enzyme interferes with CH3Cl oxidation for energy production while consuming the H4F cofactor essential for this metabolism, and that its activity opposes that of the homologous PurU enzyme required for growth with CH3Cl via the cmu pathway.Among the other mutations identified, a mutation in the nuo gene promoter could facilitate expression of the NADH dehydrogenase involved in NAD+ cofactor regeneration. Other FtfL-independent adaptations have also been detected, which differ according to the genetic context of the strain receiving the cmu pathway genes. For example, the evolved AM1 strains all show mutations in pJM105 (in the cmuA gene, with cointegration of an endogenous plasmid). However, these mutations have no impact on CmuA-dependent CH3Cl dehalogenation activity. Obtaining mutant strains by experimental evolution in the laboratory is a promising new tool for studying growth with CH3Cl via the cmu pathway, particularly given the difficulties encountered to date in directed mutagenesis approaches to CH3Cl-degrading bacteria.