Rôle de la Laminine γ1 dans la morphogenèse de la placode olfactive et le développement des axones olfactifs

Role of Laminin γ1 in olfactory placode morphogenesis and olfactory axon development

• Auteur / Autrice : Pénélope Tignard
• Direction : Marie Bréau, Alain Trembleau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 17/05/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie Paris-Seine
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Rétaux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexandra Rebsam
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Ruggiero, Nicolas David

Mots clés

Mots clés contrôlés

Danio rerio

Flux axonal

Bulbe olfactif

Placodes

Glycoprotéines

Mots clés libres

Laminine

Système olfactif

Développement

Poisson-Zèbre

Navigation axonale

Laminin

Olfactory system

Development

Zebrafish

Axon navigation

Résumé

La Laminine est l’un des composants majeurs de la matrice extracellulaire (MEC) et est essentielle à l’assemblage des membranes basales. C’est une protéine hétérotrimérique composée d’une chaîne α, d’une chaîne β et d’une chaîne γ dont l’assemblage peut former jusqu’à 20 isoformes différentes. Les Laminines s’associent avec d’autres composants des membranes basales tels que le Nidogène ou le Collagène IV pour assurer des rôles structuraux et biomécaniques. Elles assurent également un rôle signalétique en interagissant avec des récepteurs à la surface des cellules comme les Intégrines, leur récepteur principal, ou le Dystroglycan. L’une des premières isoformes à apparaître au cours du développement est l’isoforme α1β1γ1. Au cours de ma thèse, j’ai utilisé des poissons-zèbres sleepy (sly), mutés pour la chaîne γ1 de la Laminine, afin d’étudier son rôle dans le développement du système olfactif. Le développement du système olfactif chez le poisson-zèbre implique des mouvements morphogénétiques qui vont former la placode olfactive par un processus de coalescence, ainsi que la croissance des axones olfactifs qui naviguent de la placode vers le bulbe olfactif, tandis que l’ensemble de la tête de l’embryon subit un mouvement général de flexure. Lors de leur navigation vers le bulbe olfactif, les axones sortent de la placode par son point de sortie, migrent dorsalement entre les membranes basales entourant les placodes et le cerveau puis pénètrent dans le cerveau via un point d’entrée avant de poursuivre leur navigation vers la zone présomptive du bulbe olfactif. Grâce à des expériences d’immunofluorescence pour différents marqueurs des membranes basales ainsi que de microscopie électronique, nous avons montré qu’en absence de la chaîne γ1 de la Laminine, l’intégrité des membranes basales présentes autour du cerveau et des placodes olfactives est fortement perturbée. Mes analyses, mettant à profit l’utilisation de lignées transgéniques pour visualiser la mise en place de la placode olfactive ainsi que l’extension des axones olfactifs, montrent qu’aux stades de coalescence de la placode olfactive, l’absence de Laminine n’induit pas de défaut majeur, si ce n’est un positionnement de la placode légèrement décalé antérieurement qui pourrait être engendré par le déplacement antérieur du cerveau adjacent. A la suite de la coalescence, lors du mouvement de flexure du cerveau, l’absence de Laminine provoque un étirement des placodes olfactives selon l’axe de la flexure et une augmentation du nombre de cellules ectopiques autour des placodes. Les deux placodes se rapprochent médialement, réduisant la taille du cerveau et rendant floue et courbée la démarcation entre le cerveau et les placodes olfactives. La navigation des axones sensoriels olfactifs est elle aussi perturbée : certains axones sortent des placodes olfactives de manière ectopique, dorsalement par rapport au point normal de sortie, leur trajectoire est anormale et la plupart d’entre eux ne parviennent pas à atteindre le bulbe olfactif. Dans des expériences préliminaires, nous avons commencé à développer des approches visant à identifier les mécanismes en jeu dans ces régulations, en ciblant notamment le Collagène IV, dont la distribution est fortement perturbée chez les mutants sly, ainsi que les Intégrines, récepteurs principaux de la Laminine. Pour conclure, mes résultats mettent en évidence de nouveaux rôles pour la Laminine et les membranes basales dans le développement du système olfactif du poisson-zèbre, dans le maintien de la forme des placodes olfactives, dans la délimitation de la frontière entre le cerveau et les placodes, ainsi que dans la navigation des axones olfactifs vers le bulbe olfactif.

Laminin is one of the major components of the extracellular matrix (ECM), and is essential for basement membrane assembly. It is a heterotrimeric protein composed of one α, one β and one γ chain that assemble to form at least 20 different isoforms. Laminins interact with other basement membrane components such as Nidogen or Collagen IV to fulfill structural and biomechanical roles. They also achieve a signaling role by interacting with cell surface receptors such as Integrins, their main receptor, or Dystroglycan. One of the first Laminin isoform to appear during development is the α1β1γ1 isoform. During my PhD, I took advantage of the mutant zebrafish sleepy (sly) which is mutated for the γ1 chain of Laminin, to study its role along the development of the olfactory sensory system, which involves morphogenetic movements that shape the olfactory placode through placodal cell coalescence, and the navigation of the olfactory sensory axons towards the olfactory bulb in the brain. While the axons are navigating, a general flexure of the head of the embryo occurs. To reach the olfactory bulb, olfactory axons exit the olfactory placode through an exit point, navigate dorsally between the two basement membranes surrounding the brain and the olfactory placode, penetrate the brain through an entry point and continue their navigation dorsally. We performed immunofluorescence experiments for different markers of the basement membrane as well as electron microscopy and showed that, in the absence of the γ1 chain of the Laminin, the integrity of basement membranes surrounding the olfactory placode and the brain is strongly affected. Through the analysis of transgenic lines allowing the visualization of the olfactory placode and the axonal growth in mutant and wild-type contexts, we show that the absence of Laminin does not induce major defects during the coalescence stage, except for an anterior shift of the olfactory placodes that might be dragged by the anterior movement of adjacent brain cells at this stage. On the other hand, after the coalescence, during the flexure movement that has a major dorso-ventral component, the lack of Laminin induces an elongation of the olfactory placodes in the dorso-ventral axis and an increase of scattered ectopic cells around them. The two olfactory placodes also tend to move medially, decreasing the size of the brain and affecting the boundary between the two tissues, which appears more curved and fuzzy. Olfactory axon behavior is also perturbed as we saw that, without Laminin, those axons do not navigate properly towards the olfactory bulb. Our results show that only a subset of the axons manage to grow out of the placode, exiting it ectopically in a dorsal area, and that their trajectories are less directional. In preliminary experiments, we began to address the molecular mechanisms implicated in these processes, by targeting Collagen IV, another basement membrane component whose distribution is dramatically altered in the sly mutant, and Integrins, as the main Laminin receptors. In conclusion, my results document new roles for Laminin and basement membranes in the development of the olfactory system of the zebrafish. Those roles include maintaining the shape of the olfactory placode, establishing a boundary between the brain and the placodes, and participating in the navigation of olfactory axons towards the olfactory bulb.