Identification et validation de nouvelles cibles vaccinales pour prévenir l'infection du foie au cours du paludisme

Development of in vitro models for the study of the human CD8 T cell response to Plasmodium liver stage

• Auteur / Autrice : Pierre Bigeard
• Direction : Olivier Silvie, Valérie Soulard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Soutenance le 25/09/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'immunologie et des maladies infectieuses (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphanie Graff-Dubois
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Blandine Franke-Fayard, Nicolas Blanchard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jacqueline Marvel, Julius Clemence R. Hafalla

Mots clés

Mots clés contrôlés

Parasitologie

Immunologie

Antigène CD8

Lymphocytes T

Plasmodium falciparum

Paludisme

Mots clés libres

Plasmodium

Immunologie

Paludisme

Parasitologie

CD8

Plasmodium

Immunology

Malaria

Parasitology

CD8

Résumé

Le paludisme, avec plus de 247 millions de cas cliniques et 600,000 décès en 2021, est toujours un problème majeur de santé publique (WMR, 2022). Cette maladie est causée par un parasite protozoaire du genre Plasmodium et l’espèce Plasmodium falciparum est responsable de la majorité des décès. Le vaccin anti-paludique le plus avancé, nommé RTS,S/AS01 ne présente qu’une efficacité modérée. Ainsi, le développement d’un vaccin anti-paludique efficace est toujours une priorité. Le stade hépatique de Plasmodium est cible vaccinale intéressante car c’est une étape obligatoire et asymptomatique du développement du parasite chez l’hôte mammifère. Chez la souris et le singe, les lymphocytes T CD8+ (LT CD8+) ont été identifiés comme essentiels à l’immunité protectrice ciblant le stade hépatique. Plus précisément, il a été démontré in vitro et in vivo que les LT CD8+ murins sont capables de reconnaître et d’éliminer des hépatocytes infectés par Plasmodium, via l’IFN- ou la cytotoxicité directe. Néanmoins, la capacité des LT CD8+ humains à éliminer le stade hépatique de P. falciparum reste à démontrer et, à l’heure actuelle, aucun antigène protecteur du stade hépatique de P. falciparum n’a été identifié. Dans ce contexte, nous avons mis en place une approche « epitope-tagging » chez P. berghei, consistant en l’ajout d’un épitope modèle à un antigène d’intérêt. Un parasite transgénique appelé Pb-UIS4-pp65 exprimant la protéine parasitaire UIS4 fusionnée avec l’épitope modèle NLV provenant de la protéine pp65 du cytomégalovirus humain a ainsi été généré. Un test d’élimination du stade hépatique a été mis en place afin d’évaluer la capacité de LT CD8+ humains, spécifiques de l’épitope NLV, à reconnaître et éliminer le stade hépatique de Plasmodium. Nous avons ainsi pu démontrer que les LT CD8+ humains sont capables de reconnaître et éliminer les hépatocytes infectés par Pb-UIS4-pp65 de manière antigène-spécifique et HLA-restreinte, dans des lignées hépatocytaires et des hépatocytes primaires humains. L’utilisation d’anticorps neutralisant l’IFN-, ainsi que d’inhibiteurs des perforine et granzymes, a permis de démontrer que l’élimination des hépatocytes infectés se fait par cytotoxicité directe. L’utilisation de la microscopie dite « timelapse » a confirmé l’implication de l’apoptose des cellules infectées dans l’élimination du parasite par les LT CD8+ humains. Cette approche « epitope-tagging » a par la suite été transposée à P. falciparum avec la génération de parasites étiquetés sur la protéine parasitaire TRAP (Pf-TRAP-pp65), un antigène candidat vaccinal. Bien que la présence de la protéine TRAP ait été confirmée lors du stade hépatique de P. falciparum, aucune élimination du stade hépatique des parasites Pf-TRAP-pp65 par les LT CD8+ spécifiques n’a été observée. Enfin, la capacité de LT CD8+ humains spécifiques de la protéine CSP de P. falciparum (PfCSP) à reconnaître et éliminer le stade hépatique de P. falciparum et du parasite Pb-PfCSP (P. berghei exprimant la CSP de P. falciparum) a été testée. Ici aussi, bien qu’ayant confirmé la présence de la protéine PfCSP durant les stades hépatiques de P. falciparum et de Pb-PfCSP, ces derniers n’ont pas été éliminés par les LT CD8+ spécifiques de la PfCSP. A l’inverse, ces LT CD8+ ont été capables d’éliminer des cellules HepG2 transfectées pour exprimer l’antigène PfCSP. Ces travaux ont permis de démontrer la capacité de LT CD8+ humains à reconnaître et éliminer des hépatocytes primaires humains présentant à leur surface des épitopes dérivés du parasite, et d’identifier la cytotoxicité directe comme mécanisme principal de cette élimination. L’application de ce test fonctionnel et de cette approche « epitope-tagging » à d’autres antigènes de P. falciparum pourrait permettre l’identification de nouveaux candidats vaccinaux.

Malaria remains the deadliest parasitic disease with over 200 million clinical cases and 600,000 deaths in 2020. Developing an effective vaccine is essential to malaria control. So far, the most advanced malaria vaccine, the RTS,S/AS01, which targets the major surface antigen of the extracellular sporozoite stage, has shown only limited efficacy. Plasmodium development in the liver is known as a key stage to target for achieving sterile protection. In mice and monkeys, CD8 T cells have been identified as essential players in protective immunity targeting the liver stage (LS). More precisely, murine CD8 T cells have been shown to recognize and eliminate, both in vitro and in vivo, infected hepatocytes, either through IFN- or direct cytotoxicity. However, whether human CD8 T cells are also able to recognize and eliminate P.falciparum LS is totally unknown. Moreover, our knowledge of protective LS antigens is scarce. To address these questions, we used an epitope tagging approach in P. berghei (Pb) and generated transgenic parasite expressing the HLA-A2*01-restricted NLV epitope from human CMV pp65 protein, in frame with Pb-UIS4 for expression during the LS. We set up a Liver Stage Killing Assay (LSKA) to assess recognition and killing of LS by cognate human CD8 T cells. Using this assay, we observed that human CD8 T cells are able to recognize and kill Plasmodium LS in a dose-dependent, antigen-specific and HLA-restricted manner. These results were first obtained in hepatic cell lines and then confirmed in primary human hepatocytes. Then, using anti-IFN- neutralizing Ab and chemical inhibitors of perforin or granzyme secretion, we further showed that this killing is mediated by direct cytotoxicity and not by IFN-, and is not influenced by LS maturity. Finally, time-lapse imaging allowed us to describe apoptosis events associated with LS killing. Thus, our results show, for the first time, that human CD8 T cells are able to recognize Plasmodium-derived antigen processed and presented by infected human hepatocytes and to eliminate them, direct cytotoxicity being very effective in achieving this goal. This epitope-tagging approach was then translated to P. falciparum with the generation of parasites tagged on the TRAP parasite protein (Pf-TRAP-pp65), a candidate vaccine antigen. Although the presence of the TRAP protein was confirmed during the liver stage of P. falciparum, no elimination of the Pf-TRAP-pp65 liver stage parasites by specific CD8+ LT was observed. Finally, the ability of human CD8+ LTs specific for the P. falciparum CSP protein (PfCSP) to recognize and eliminate the hepatic stage of P. falciparum or of a Pb-PfCSP parasite (P. berghei expressing the P. falciparum CSP) was tested. Here again, although the presence of the PfCSP protein was confirmed during the hepatic stages of P. falciparum and Pb-PfCSP, the latters were not eliminated by PfCSP-specific CD8+ TL. Conversely, these CD8+ LT were able to eliminate HepG2 cells transfected to express the PfCSP antigen. This work demonstrated the ability of human CD8+ LT to recognize and eliminate primary human hepatocytes displaying parasite-derived epitope on their surface, and identified direct cytotoxicity as the main mechanism of this elimination. The application of this functional assay and epitope-tagging approach to other P. falciparum antigens could lead to the identification of new liver stage vaccine target.