Étude biochimique in vitro des complexes Nonsense-Mediated mRNA Decay chez Saccharomyces cerevisiae

In vitro biochemical study of Nonsense-mediated mRNA Decay complexes in Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Nadia Ruiz Gutierrez
• Direction : Hervé Le Hir
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 22/09/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Dominique Weil
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marina Pinskaya, David Gatfield, Marc Boudvillain
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jan Kadlec, Isabelle Behm-Ansmant

Mots clés

Mots clés contrôlés

Micromanipulation

Interactions protéine-protéine

ARN hélicases

Détérioration

ARN

Mots clés libres

Dégradation ARN

Reconstitution de complexes

Pinces magnétiques

Purification de protéines

RNA Decay

Complex reconstitution

Magnetic Tweezers

Protein purification

Résumé

La fidélité de l'expression génétique et le contrôle qualité des ARNm sont essentiels à l'homéostasie cellulaire. Chez les eucaryotes, la voie Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) est un processus de surveillance essentiel qui détecte et élimine les ARNm aberrants contenant des codons de terminaison prématurés (PTC). Au cœur de cette voie se trouve l'hélicase à ARN Upf1, qui comprend un domaine hélicase flanqué d'un domaine régulateur riche en cystéine et en histidine (CH) et d'un domaine C-terminal désordonné. Upf1 orchestre la reconnaissance et la dégradation des transcrits contenant un PTC. Cependant, le mécanisme précis par lequel Upf1 déclenche la dégradation des ARNm reste mal compris. Des études biochimiques récentes ont mis en évidence deux complexes mutuellement exclusifs chez Saccharomyces cerevisiae : le complexe Upf1-détecteur composé d’Upf2 et Upf3 et le complexe Upf1-decapping, comprenant Dcp1, Dcp2, Nmd4 et Ebs1. Ce projet de thèse visait à reconstituer le complexe Upf1-decapping in vitro en utilisant des protéines recombinantes afin de caractériser le rôle d'Upf1 et de ses partenaires dans les étapes tardives du NMD. Nous avons notamment identifié une interaction directe entre Dcp2 et le domaine CH d'Upf1, ainsi que des interactions directes entre différents domaines d'Upf1, Nmd4 et Ebs1, formant un complexe stable Upf1-decapping. Comme chez l'homme, Upf2 interagit avec le domaine CH. De manière intéressante, cette interaction est incompatible avec la liaison de Dcp2, ce qui explique l’incompatibilité entre les complexes Upf1-détecteur et Upf1-decapping. En outre, nos recherches ont révélé que la liaison de d’ Upf1 à l’ARN est presque abolie en présence d'Upf2, mais qu'elle est considérablement renforcée au sein du complexe Upf1-decapping. Ainsi, Upf1 faciliterait l'association des protéines de decapping sur ses ARNm cibles, assurant ainsi une dégradation ciblée. En outre, nous avons exploré les mécanismes d'autorégulation et les propriétés fonctionnelles des hélicases Upf1 de la levure et de l'homme sur l'ARN et l'ADN. Des analyses comparatives à l’échelle de la molécule unique à l'aide de pinces magnétiques ont révélé des comportements autorégulateurs opposés de l'activité de l'hélicase Upf1 sur l'ARN malgré leur grande conservation. Dans l'ensemble, cette étude fournit des informations précieuses sur l'importance fonctionnelle de l'hélicase Upf1 pour recruter la machinerie de dégradation des ARNm défectueux, contribuant ainsi à notre compréhension du métabolisme de l'ARN.

Gene expression fidelity and RNA quality control are crucial for cellular homeostasis. In eukaryotes, the Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) pathway serves as an essential surveillance process that detects and eliminates aberrant mRNAs harboring premature termination codons (PTCs). At the heart of this pathway lies the conserved RNA helicase Upf1 encompassing a helicase domain flanked by a cysteine- and histidine-rich regulatory domain (CH) and a disordered C-terminal domain. Upf1 orchestrates the recognition and the degradation of PTC-containing transcripts, although the precise mechanism by which Upf1 triggers mRNA decay remains elusive. Recent biochemical studies have uncovered two mutually exclusive complexes in Saccharomyces cerevisiae: the Upf1-detector complex consisting of Upf2 and Upf3 and the Upf1-decapping complex, including Dcp1, Dcp2, Nmd4 and Ebs1. This thesis project aimed to reconstitute the Upf1-decapping complex in vitro using recombinant proteins to characterize the role of Upf1 and its partners in the late steps of NMD. Notably, we identified a direct interaction between Dcp2 and the CH domain of Upf1, as well as direct interactions between different domains of Upf1 and Nmd4 and Ebs1, forming a stable Upf1-decapping complex. Similar to humans, yeast Upf2 also interacts with the CH domain. Interestingly, this interaction is incompatible with Dcp2 binding providing insight into the switch between the Upf1-detector and the Upf1-decapping complexes. Additionally, our investigations revealed that Upf1’s RNA binding is nearly abolished in the presence of Upf2 but significantly enhanced within the Upf1-decapping complex. Thus, Upf1 facilitates the association of the decapping proteins on its target mRNAs, ensuring proper degradation. Furthermore, we explored the autoregulatory mechanisms and functional properties of yeast and human Upf1 helicases on RNA and DNA. Comparative single-molecule analyses using magnetic tweezers revealed contrasting autoregulatory behaviors of Upf1 helicase activity on RNA despite their high conservation. Altogether, this comprehensive study provides valuable insights into the functional importance of the Upf1 helicase to recruit the decay machinery to faulty mRNAs, contributing to our understanding of RNA metabolism.