Mobilisation et incorporation enzymatique du soufre lors de réactions non-redox impliquant un centre [4Fe-4S] : étude biochimique et structurale d’une cystéine désulfidase et d’une sulfurtransférase

Enzymatic mobilization and incorporation of sulfur during non-redox reactions involving a [4Fe-4S] cluster : biochemical and structural study of a cysteine desulfidase and a sulfurtransferase

• Auteur / Autrice : Paolo Zecchin
• Direction : Béatrice Golinelli-Pimpaneau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 21/12/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie des processus biologiques (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Vénien-Bryan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît D'Autréaux, Julien Henri
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yvain Nicolet, Sandrine Boschi-Muller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Structure cristalline (solides)

Enzymes

Cystéine

Centres fer-soufre

Soufre -- Composés

Mots clés libres

Métabolisme du soufre

Cystéine désulfidase

Sulfurtransférase

Cluster [Fe-S]

Structure cristallographique

Mécanisme catalytique

Sulfur metabolism

Cysteine desulfidase

Sulfur insertase

[Fe-S] cluster

Crystal structure

Catalytic mechanism

Résumé

Les composés soufrés, tels que la cystéine et certains cofacteurs, jouent un rôle essentiel dans les processus cellulaires. Cette thèse se concentre sur deux enzymes dépendantes d’un centre [4Fe-4S], impliquées dans le métabolisme du soufre chez l'archée anaérobie Methanococcus maripaludis : MmCyuA, une L-cystéine désulfidase, et MmLarE, une sulfurtransférase dépendante de l'ATP. La première partie porte sur MmCyuA, qui catalyse la conversion de la L-cystéine en sulfure d’hydrogène et 2-aminoacrylate, ultérieurement transformé en pyruvate et ammoniac. Les structures cristallographiques de MmCyuA, que nous avons obtenues, seule et en présence de l'inhibiteur sérine ou du produit pyruvate, sont les premières structures d'une cystéine désulfidase. Ces structures ainsi que nos résultats biochimiques et analyses spectroscopiques révèlent l’aptitude de MmCyuA à lier un cluster [4Fe-4S], indispensable à l’activité catalytique, via trois ou quatre cystéines. La structure de l'enzyme en complexe avec la sérine mime l'étape initiale de la réaction et suggère un mécanisme de désulfuration de la cystéine impliquant la formation d'un intermédiaire [4Fe-5S]. Des expériences comparatives de croissance de la souche sauvage de M. maripaludis et de la souche mutante dépourvue de l'enzyme MmCyuA soulignent l’importance de MmCyuA pour une croissance cellulaire optimale et pour permettre une croissance où la cystéine est utilisée comme unique source de soufre. Nous proposons que MmCyuA puisse transférer le sulfure lié au cluster à des accepteurs en aval des voies de biosynthèse des composés soufrés, tels que les enzymes de thiolation dépendantes d’un centre [4Fe-4S]. La deuxième partie concerne la structure et le mécanisme de MmLarE. Cette enzyme catalyse la conversion séquentielle des deux groupes carboxylates du précurseur du cofacteur de la lactate racémase en thiocarboxylates. Deux classes d’enzymes LarE existent, qui utilisent un mécanisme sacrificiel où une cystéine sert de source de soufre ou un mécanisme dépendant d’un cluster [4Fe-4S]. Nous rapportons la première structure cristallographique d'une enzyme LarE [4Fe-4S]-dépendante, sous ses formes apo (sans cluster) et holo (avec cluster). La structure de holo-MmLarE montre un cluster [4Fe- 4S], coordonné par trois cystéines seulement, avec le quatrième atome de fer lié à un ligand anionique (chlorure ou groupement phosphate). Ces structures, appuyées par nos études spectroscopiques, nous permettent de proposer un mécanisme dans lequel le cluster [4Fe-4S] lie un hydrogénosulfure, formant un intermédiaire [4Fe-5S]. Ce processus est similaire à celui des enzymes de thiolation de l'ARNt dépendantes d’un cluster [4Fe-4S].

Sulfur-containing compounds, such as cysteine and certain cofactors, play crucial roles in cellular processes. This thesis explores the sulfur metabolism in the anaerobic archaeum Methanococcus maripaludis, focusing on two [4Fe-4S]-dependent enzymes: L-cysteine desulfidase MmCyuA and ATP-dependent sulfur insertase MmLarE. The first part focuses on MmCyuA, which catalyzes the decomposition of L-cysteine into hydrogenosulfide and 2-aminoacrylate, subsequently converted into pyruvate and ammonia. The crystal structures of MmCyuA that we obtained, alone and in the presence of the serine inhibitor or the pyruvate product, are the first structures of a cysteine desulfidase. These structures, together with our biochemical results and spectroscopic analysis, reveal the capacity of MmCyuA to bind a [4Fe-4S] cluster, required for activity, using three or four cysteines. The structure of the enzyme in complex with serine mimics the initial step of the reaction and suggest a desulfuration mechanism for cysteine that involves the formation of a [4Fe-5S] intermediate. Comparative growth experiments between wild-type and CyuAdeficient M. maripaludis strains highlight the important role of MmCyuA for optimal growth and to enables growth using cysteine as the sole sulfur source. We propose that MmCyuA could transfer the cluster-bound sulfide to downstream acceptors, along the biosynthetic pathways of sulfurated compounds, such as [4Fe-4S]-dependent thiolation enzymes. The second part details the structure and mechanism of MmLarE. This enzyme catalyzes the sequential conversion of the two carboxylate groups of the precursor of the lactate racemase cofactor into thiocarboxylates. Two classes of LarE enzymes exist, using a sacrificial mechanism, in which a cysteine serves as the sulfur source, or a [4Fe-4S] cluster-dependent mechanism. We present the first crystal structure of a [4Fe-4S]-dependent LarE enzyme, in both its apo (without cluster) and holo (with cluster) forms. The crystal structure of holo-MmLarE reveals a [4Fe-4S] cluster coordinated by three cysteines only, with the fourth iron atom bound to an anionic ligand (chloride or phosphate group). These structures, along with our spectroscopic studies, support a mechanism in which the [4Fe-4S] cluster binds a hydrogenosulfide ligand, forming a [4Fe-5S]