Analyses fonctionnelles de la capsule de Legionella longbeachae pour comprendre son rôle dans la détection immunitaire de l'hôte et la persistance environnementale

Functional analyses of the Legionella longbeachae capsule to understand its role in host immune sensing and environmental persistence

• Auteur / Autrice : Silke Schmidt
• Direction : Carmen Buchrieser, Pedro Escoll
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Soutenance le 26/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Génétique des génomes
• Jury : Président / Présidente : Nicolas Biais
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hubert Hilbi, Jean-Pierre Gorvel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Charles Van der Henst, Géraldine Laloux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phagocytes

Microscopie confocale

Microscopie électronique en transmission

Polysaccharides

Résistance aux maladies

Légionelles

Mots clés libres

Microbiologie

Capsule

Immunité innée

Microbiology

Capsule

Innate immunity

Résumé

Les légionelles sont des bactéries intracellulaires facultatives qui peuvent provoquer une pneumonie grave chez l'Homme, la légionellose. Lors de l'infection, les bactéries utilisent un arsenal de plusieurs centaines de protéines effectrices pour détourner la cellule hôte et établir leur niche de réplication intracellulaire. Mon doctorat porte sur Legionella longbeachae, une espèce unique dans tout le genre des légionelles car elle est la seule à coder une capsules dans son génome. Les capsules sont des structures polysaccharidiques complexes, attachées à la membrane externe des bactéries. Elles aident les bactéries à survivre dans des conditions environnementales défavorables et peuvent également contribuer à l'évasion immunitaire et à retarder l'absorption par les cellules phagocytaires. En utilisant la microscopie électronique à transmission, j'ai pu montrer que L. longbeachae exprime effectivement une capsule à sa surface. L'expression de la capsule est régulée en fonction de la phase de croissance, et elle est fortement transcrite au cours de la phase exponentielle. L'expression à la surface ne se produit cependant qu'en phase de croissance tardive. De plus, en utilisant un double rapporteur de fluorescence, j'ai pu montrer par microscopie confocale en direct que la capsule est transcrite intracellulairement lors de l'infection des cellules phagocytaires. Les bactéries de type sauvage sont très virulentes dans un modèle d'infection chez la souris. En revanche, un mutant dans le transporteur de la capsule, qui n'est donc pas encapsulé, est complètement avirulent chez les souris. En outre, le mutant de la capsule présente un grave défaut de réplication chez l'amibe, l'hôte environnemental de la bactérie. Cela indique que la capsule joue un rôle essentiel lors de l'infection par L. longbeachae. De plus, j'ai pu montrer que les bactéries de type sauvage retardent la phagocytose dans les cellules hôtes, contrairement au mutant qui est facilement absorbé par les cellules phagocytaires. La présence de la capsule freine également la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les macrophages humains primaires par rapport au mutant de la capsule. La purification de la capsule et l'analyse par électrophorèse sur gel et HPLC montrent que L. longbeachae exprime un polysaccharide hautement anionique qui est absent chez le mutant de la capsule. Les résultats obtenus apportent la preuve d'un nouveau mécanisme de virulence de L. longbeachae et peuvent nous aider à comprendre comment ces bactéries peuvent provoquer des maladies chez l'Homme.

Legionella are facultative intracellular bacteria that can cause a severe pneumonia in humans, called Legionnaires’ disease. Upon infection, the bacteria use an arsenal of several hundred effector proteins to hijack the host cell and establish their intracellular replication niche. My PhD focuses on Legionella longbeachae, a species that is unique in the entire genus as it is the only one to encode a capsule cluster in its genome. Capsules are complex polysaccharide structures attached to the outer membrane of bacteria. They help the bacteria to survive adverse environmental conditions and they may also help in immune evasion and to delay engulfment by phagocytic cells. Using transmission electron microscopy, I could show that L. longbeachae indeed expresses a capsule on its surface. The capsule expression is regulated in a growth phase-dependent manner, and it is highly transcribed in exponential growth. Expression on the surface, however, only occurs in late growth phase. Furthermore, using a dual fluorescence reporter, I could show by live confocal microscopy that the capsule is transcribed intracellularly upon infection of phagocytic cells. The wild type bacteria are highly virulent in a mouse model of infection. In contrast, a mutant in the capsule transporter, which is non-encapsulated, is completely avirulent in mice. Additionally, the capsule mutant shows a severe replication defect in amoeba, the environmental host of the bacteria. This indicates that the capsule plays an essential role during infection of L. longbeachae. Further, I could show that wild type bacteria delay phagocytosis into host cells, in contrast to the mutant that is readily taken up by phagocytic cells. In addition, the presence of the capsule dampens the secretion of pro-inflammatory cytokines from primary human macrophages as compared to the capsule mutant. Purification of the capsule and analysis by gel electrophoresis and HPLC show that L. longbeachae expresses a highly anionic polysaccharide that is absent in the capsule mutant. The results obtained provide evidence for a novel virulence mechanism of L. longbeachae and may inform our understanding of how these bacteria can cause disease in humans.