Rôle de whiB6 et kdpDE dans le clone MDR hypertransmissible B0/W148 de Mycobacterium tuberculosi

Role of whiB6 and kdpDE in the successful MDR clone Mycobacterium tuberculosis B0/W148

• Auteur / Autrice : Isabelle Bonnet
• Direction : Régis Tournebize
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Soutenance le 22/12/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'immunologie et des maladies infectieuses (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Emmanuel Hugonnet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Roland Brosch, Nathalie de Castro
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nadine Lemaître, Priscille Brodin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génome

Résistance aux antibiotiques

Antituberculeux

Tuberculose

Mycobacterium tuberculosis

Mots clés libres

Mycobacterium tuberculosis

WhiB6

KdpDE

Résumé

La tuberculose (TB) est, hors COVID, la première cause de décès lié à un agent infectieux. La détermination rapide du profil de résistance complet de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est essentielle pour démarrer un traitement adapté dans les cas de TB multirésistante (MDR) et ainsi limiter l’acquisition de résistances supplémentaires, augmenter les chances de succès thérapeutique et réduire la transmission de ces souches. Il existe 9 lignées principales au sein du complexe M. tuberculosis, dont 2 sont largement répandues dans le monde (L2 et L4). Au sein de la lignée 2, le clone W148 (ou complexe clonal CC 100-32) a diffusé récemment en Europe et en Asie. Cette diffusion pourrait s'expliquer par des mutations spécifiques au sein du génome.En premier lieu, nous avons étudié la technologie Deeplex Myc-TB pour détecter rapidement le génotype et la résistance des souches cliniques de Mtb MDR. Cette technologie, basée sur une PCR multiplex et un séquençage haut débit, détermine à la fois l’espèce (hsp65), le génotype (spoligotype) et la résistance à 13 antituberculeux de première et seconde ligne (18 cibles). Le travail d’évaluation a inclus 112 prélèvements et 94 souches adressés au Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). Nous avons observé que le test Deeplex Myc-TB fonctionne sur prélèvement positif à l’examen microscopique et sur souche. Les profils de résistance obtenus sont concordants à 85,4% avec les résultats de la méthode phénotypique de référence. L'utilisation de Deeplex Myc-TB fournit des résultats en une dizaine de jours, soit environ 6 semaines avant ceux de l’antibiogramme phénotypique. Deeplex Myc-TB permet donc d’adapter l’antibiothérapie bien avant que ce qui était fait jusqu’à présent, pour le bénéfice des patients. Nous avons ainsi pu valider cet outil maintenant utilisé en routine au CNR MyRMA. Nous avons ensuite étudié les mutations spécifiques du CC 100-32 MDR. L’analyse du génome complet de 36 souches reçues au CNR MyRMA a permis d’identifier 30 mutations non synonymes et petites délétions spécifiques. Parmi elles, nous avons choisi d’étudier celles présentes dans kdpD et whiB6, car des données de la littérature semblent montrer un impact de ces gènes sur la virulence de la souche. KdpDE est un système à deux composants régulant l’expression du système de transport du potassium inductible KdpFABC. La mutation présente dans le complexe CC 100-32 MDR est une délétion de 2 nucléotides à la fin du gène kdpD entraînant une protéine de fusion KdpDE. Nous avons donc construit un tel mutant chez Mtb H37Rv en supprimant les deux gènes kdpD et kdpE avant de le complémenter avec la forme sauvage ou mutée de kdpDE. Nous n’avons pas observé de différence de croissance in vitro des différentes souches, y compris en l’absence de potassium, suggérant que KdpDE n’est pas essentiel pour le fitness de la bactérie en présence et absence de potassium. L’étude de l’impact de la délétion sur l’activité transcriptionnelle et la virulence est en cours. D’autre part, WhiB6 est un facteur de transcription qui régule le système ESX-1, nécessaire à la virulence. Des travaux du laboratoire ont permis d'obtenir le mutant ∆whiB6 et les souches complémentées WT et mutée (T51P) et leur ré-analyse indique que la souche mutée T51P entraîne une production d’ESAT-6 et de cytokines pro-inflammatoires plus faible que la souche sauvage ; nous réalisons actuellement une analyse du transcriptome. Les premiers résultats obtenus semblent indiquer que la mutation T51P dans WhiB6 entraîne moins de virulence et d’inflammation. Ce travail a permis de valider un outil maintenant indispensable au diagnostic des TB MDR en routine au CNR MyRMA et d’étudier la diffusion d’un clone MDR à travers les fonctions de deux facteurs de transcription impliqués dans la virulence.

Tuberculosis (TB) is, excluding COVID, the leading cause of death linked to an infectious agent. Rapid determination of the full resistance profile of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is essential to initiate appropriate treatment of multidrug resistant (MDR) cases, thereby limiting the acquisition of additional resistance, increasing the chances of therapeutic success and reducing transmission of these strains. There are 9 main lineages within the M. tuberculosis complex, 2 of which are widespread throughout the world (L2 and L4). Within lineage 2, the clone W148 (or clonal complex CC 100-32) has recently spread to Europe and Asia. This spread could be explained by specific mutations within the genome.First, we investigated the Deeplex Myc-TB tool for rapid detection of genotype and resistance in clinical Mtb MDR strains. The Deeplex Myc-TB technology, based on multiplex PCR and high-throughput sequencing, determines species (hsp65), genotype (spoligotype) and resistance to 13 first- and second-line anti-tuberculosis drugs (18 targets). Our evaluation included 112 samples and 94 strains sent to the Centre National de Référence des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux (CNR MyRMA). We have observed that the Deeplex Myc-TB test is efficient on microscopically positive samples and strains. The resistance profiles obtained are 85.4% concordant with the results of the phenotypic reference method. The use of Deeplex Myc-TB provides results within ten days, and around 6 weeks before those of the phenotypic antibiogram. Deeplex Myc-TB can therefore be used to adapt antibiotic therapy much earlier than was previously possible, to the patient benefit. We were thus able to validate this tool, which is now routinely used at CNR MyRMA. We next studied mutations specific to CC 100-32 MDR. Genome-wide analysis of 36 strains received at CNR MyRMA identified 30 non-synonymous mutations and small deletions specific to CC 100-32 MDR strains. Among these, we chose to study mutations present in kdpD and whiB6, as data in the literature indicated an impact of these genes on the virulence of the strain. On the one hand, KdpDE is a two-component system regulating expression of the inducible potassium transport system KdpFABC. The mutation present in the CC 100-32 MDR complex is a 2-nucleotides deletion at the end of the kdpD gene, resulting in a KdpDE fusion protein. We therefore constructed such a mutant in Mtb H37Rv by deleting both the kdpD and kdpE genes before complementing it with the wild-type or mutated form of kdpDE. We observed no difference in the in vitro growth of the different strains, even in the absence of potassium, suggesting that KdpDE is not essential for bacterial fitness in presence or absence of potassium. The impact of the deletion on transcriptional activity and virulence is currently being studied. On the other hand, WhiB6 is a transcription factor that regulates the ESX-1 system, necessary for virulence. Work from the laboratory generated a ∆whiB6 mutant and the complemented WT and mutated (T51P) strains and their re-analysis indicated that T51P mutant strain produces less ESAT-6 and pro-inflammatory cytokines than the wild-type strain. Our transcriptome analysis of these strains is currently underway. Initial results suggest that the T51P mutation in WhiB6 results in less virulence and inflammation. This work has validated a tool that is now essential for routine diagnosis of MDR TB at CNR MyRMA, and to study the spread of an MDR clone through the function of two transcription factors involved in virulence.