Étude de l'interaction de Pin1 avec la phosphatase Cdc25C et une nouvelle série de ligands spécifiques à un domaine

Investigation of Pin1 interaction with the Cdc25C phosphatase and a novel series of domain-specific ligands

• Auteur / Autrice : Stephanie Davidson
• Direction : Ludovic Carlier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 31/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-2024)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Brigaud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christina Sizun, François-Xavier Theillet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laure Guilhaudis, Isabelle Landrieu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphorylation

Ligands (biochimie)

Phosphatases

Peptides

Mots clés libres

Pin1

Cdc25C

RMN

Phosphorylation

Pin1

Cdc25C

NMR

Phosphorylation

IDP

Résumé

L'enzyme Pin1, membre de la famille des PPIases, joue un rôle clé en catalysant l'isomérisation cis/trans des liaisons peptidiques de la proline, modifiant la conformation des protéines cibles. Pin1 est un régulateur clé de divers processus biologiques, y compris le cycle cellulaire, et sa surexpression a été associée à de nombreux types de cancer, soulignant son potentiel en tant que cible thérapeutique. Pin1 diffère des autres PPIases en ce qu'elle reconnaît et isomérise spécifiquement les motifs pS/T-P des substrats. Cette petite enzyme (18,2 kDa) se compose de deux domaines, un domaine WW de liaison au ligand et un domaine PPIase catalytique. Les deux domaines se lient aux mêmes motifs phosphorylés dans les substrats, mais le domaine PPIase se lie préférentiellement aux motifs dans la conformation cis et le domaine WW se lie presque exclusivement à l'isomère trans. Cependant, le mécanisme de liaison et la relation entre ces deux domaines demeurent incompris. Malgré de nombreuses tentatives pour développer des inhibiteurs de Pin1 contre le cancer, les composés existants ont montré des limites en termes de puissance, de spécificité et de biodisponibilité. Nous avons entrepris deux projets pour comprendre le mécanisme de liaison de Pin1. Tout d'abord, nous avons analysé la liaison d'une nouvelle bibliothèque de ligands peptidiques de Pin1, inspirée d'une première génération de composés produits précédemment par le laboratoire, en vue d'une application future potentielle pour candidats anticancéreux. Les nouveaux ligands ont été conçus pour améliorer leur puissance, faciliter leur synthèse et augmenter leur biodisponibilité. En outre, des stratégies d'abolition de Pin1 ont été testées : l'inhibition catalytique classique par inhibiteurs compétitifs et l'utilisation de la technologie PROTAC. La stratégie PROTAC implique la conception de chimères ligand/ubiquitine ligase de Pin1, ciblant Pin1 pour la dégradation dans les cellules. Les nouveaux ligands ont été testée avec des titrages RMN pour extraire les valeurs KD au niveau du résidu. Nous avons identifié un composé principal de la série PROTAC qui se lie au domaine WW de Pin1 avec une affinité de liaison de l'ordre du micromolaire. Nous avons aussi optimisé un test d'activité Pin1 basé sur des expériences NMR EXSY afin de comparer l'activité inhibitrice de nos ligands. Nous avons démontré que les ligands spécifiques des domaines WW et PPIase présentent une activité inhibitrice comparable. Cela suggère que l'occlusion du domaine WW est suffisante pour inhiber l'isomérisation par le domaine PPIase. Une partie essentielle de ce travail a été de caractériser structurellement l'interaction de Pin1 avec la phosphatase Cdc25C, un régulateur clé du cycle cellulaire, notamment de la mitose. Cdc25C comprend un domaine catalytique en C-terminal et une région N-terminale, intrinsèquement désordonnée (IDR) contenant six motifs potentiels de liaison à Pin1. Bien qu'il s'agisse d'un partenaire connu de Pin1, les détails, au niveau structurel, de cette interaction restent largement inexplorés. Ici, nous avons utilisé RMN pour étudier l'interaction entre Pin1 et l'IDR de Cdc25C. Nous présentons la première caractérisation structurale de l'IDR de Cdc25C, confirmant expérimentalement sa nature intrinsèquement désordonnée et rapportant une attribution complète du squelette par RMN. Nous avons confirmé que Pin1 interagissait faiblement avec l'IDR non phosphorylé et un mutant phosphomimétique de l'IDR de Cdc25C. Enfin, l'IDR de Cdc25C a été phosphorylé in vitro pour produire une forme triphosphorylée. La phosphorylation a augmenté l'interaction avec Pin1, révélant que le domaine WW est le principal module de liaison pour l'IDR phosphorylé de Cdc25C. De plus, nous avons révélé que Pin1 n’a pas de préférence de forte liaison entre les trois motifs phosphorylés.

Pin1 is a member of the PPIase family of enzymes which catalyse the cis/trans isomerisation of proline peptide bonds, inducing a conformational change in their target proteins. Pin1 is a regulator of key biological processes, including the cell cycle, and its overexpression has been linked to numerous cancers, highlighting its potential as a therapeutic target. Pin1 specifically recognises and isomerises pS/T-P motifs within substrates. The enzyme is small (18.2 kDa) and organised into two domains, a ligand-binding WW domain and a catalytic PPIase domain. Although both domains bind to the same phosphorylated motifs within substrates, the PPIase domain displays preferential binding to motifs in the cis conformation, whilst the WW domain almost exclusively binds to the trans isomer. The mechanism of Pin1 binding and the relationship between the two domains is not fully understood. In particular, it is unclear how Pin1 recognises and interacts with protein partners containing multiple pS/T-P motifs. Despite many attempts to develop Pin1 inhibitors as anticancer drugs, existing compounds have exhibited limited potency, specificity, and bioavailability. In order to shed more light on the binding mechanism of Pin1, two projects were undertaken. Firstly, we analysed the binding of a novel library of Pin1 peptide ligands, inspired by a first-generation of compounds produced previously by the lab, for potential application as anti-cancer drugs. Notably, the second-generation ligands tested strategies to enhance potency, facilitate synthesis and increase bioavailability. In addition, strategies for Pin1 abolition were tested: classic catalytic inhibition by competitive inhibitors, and the use of PROTAC technology. The PROTAC strategy involves the design of Pin1 ligand/ubiquitin ligase chimeras which target Pin1 for degradation in cancer cells. The binding of the second-generation library to Pin1 was assessed by observing CSPs in NMR titrations, facilitating the extraction of KD values at the residue level. We have identified a lead compound of the PROTAC series which displays specific binding to the WW domain of Pin1 with a KD within the micromolar range. In addition, we have optimised a Pin1 activity assay based on NMR EXSY experiments to compare the inhibitory activity of ligands of the first- and second-generation libraries. Significantly, we demonstrated that both WW- and PPIase-domain specific ligands display comparable inhibitory activity. This finding suggests that occlusion of the WW domain substrate binding pocket is sufficient to inhibit isomerisation of a Pin1 substrate by the PPIase domain. There is a lack of structural studies focusing on Pin1's interactions with full-length protein partners. Therefore, another major part of this work involved structurally characterising the interaction between Pin1 and the Cdc25C phosphatase, a critical regulator of the cell cycle that acts as a gatekeeper to mitosis. Cdc25C consists of a C-terminal catalytic domain and an N-terminal IDR, which is host to six potential Pin1 recognition motifs. Despite being a known Pin1 binding partner, the details of this interaction remain largely unexplored. Here, we used NMR to study the interaction between Pin1 and the IDR of Cdc25C. We present the first structural characterisation of the IDR of Cdc25C, experimentally confirming its intrinsically disordered nature and reporting a full NMR backbone assignment. We confirmed that Pin1 displayed weak interaction with both the unphosphorylated IDR and a phosphomimetic mutant of the Cdc25C IDR. Finally, the Cdc25C IDR was phosphorylated in vitro to produce a tri-phosphorylated form. Phosphorylation significantly increased affinity for Pin1, revealing that the WW domain acts as the principal binding module for the IDR of Cdc25C. In addition, it appears that Pin1 displays no strong binding preference between the three phosphorylated motifs.