Caractérisation de l'utilisation des AAV pour l'expression de gènes dans l'oreille interne en développement, et implications pour l'étude du rôle de la voie de signalisation Sonic Hedgehog dans l'organisation de l'épithélium cochléaire

Characterization of the use of AAVs as tools for in utero gene delivery and implications for the study of role of Sonic Hedgehog signaling in the differentiation and patterning of the cochlear epithelium

• Auteur / Autrice : Carla Maria Barbosa Spinola
• Direction : Raphaël Etournay
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 04/10/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur. Département de l'Institut de l’audition – centre de l’Institut Pasteur (2019-….)
• Jury : Président / Présidente : Robert Kelly
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christine Vesque
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Doris Wu, Oumeya Adjali

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cochlée

Épithélium

Protéine Sonic hedgehog

Développement

Oreille interne

Expression génique

Dependovirus

Mots clés libres

Développement

Epithélium

Sonic Hedgehog

AAV

Différenciation

Organisation

Development

Epithelium

Sonic Hedgehog

AAV

Differentiation

Patterning

Résumé

La cochlée est l'organe sensoriel auditif des mammifères. Il s'agit d'un long organe spiralé qui décompose les sons complexes en ses fréquences distinctes analysées à différentes positions le long de son axe longitudinal. Cette organisation de la cochlée en fonction de la fréquence tient à ses propriétés morphologiques et mécaniques qui varient progressivement le long de son axe longitudinal, également appelé axe basal-apical. Des études antérieures ont montré que la voie de signalisation Sonic Hedgehog (Shh) contrôle l'établissement de l'axe basal-apical de la cochlée, sa taille, et la différenciation de ses cellules sensorielles auditives. Cependant, les périodes pendant lesquelles Shh contrôle ces processus distincts au cours du développement embryonnaire ne sont pas bien définies. On ne sait pas non plus comment les gradations morphologiques apparaissent le long de l'axe basal-apical de la cochlée, ni comment la signalisation Shh contribue à ces processus. Mon projet de thèse s'inscrit dans le cadre de ces questions et mes objectifs étaient (i) de caractériser l'activité de la voie Shh dans l'épithélium neurosensoriel cochléaire en développement et (ii) de développer des outils pour manipuler l'expression génique, temporellement et spatialement, dans la cochlée en développement, pendant les stades de développement embryonnaire de la souris, en mettant principalement l'accent sur la signalisation Shh. Pour caractériser l'activité de signalisation de Shh, j'ai d'abord imagé des cochlées entières prélevées aux stades embryonnaires E13.5 et E14.5 et exprimant le gène rapporteur de Gli Tg(GBS-GFP). Mais l’absence de signal GFP spécifique dans l'épithélium suggère que la signalisation de Shh pourrait être trop faible pour être détectée par cette approche. J'ai ensuite réalisé un RNAscope sur des sections de tête entière d'embryons (de E12.5 à E15.5), en utilisant des sondes ciblant les composants de la voie Shh (Gli1-3, Patched1 et Sonic Hedgehog). Globalement, ces gènes sont exprimés dans l'épithélium sensoriel et les tissus environnants. Notons que Patched1 présente une expression graduelle, avec une expression maximale à l'apex cochléaire à des stades plus avancés (E15.5), près de la source connue de Shh dans le ganglion spiral, ce qui suggère une modulation de la signalisation de Shh par l'épithélium. Parallèlement, j'ai caractérisé le taux de transduction de deux vecteurs viraux adéno-associés (AAV), AAV-PHP.eB et AAV-DJ, aux stades embryonnaires, leur transduction élevée des cellules de l’épithélium sensoriel n’étant connue qu’aux stades postnataux. J’ai mis au point la procédure chirurgicale permettant de réaliser des injections in utero dans l'oreille interne, à partir de 13.5. En quantifiant le taux de transduction de l'AAV-PHP.eB à 48h, 72h et ~5 jours après l'injection, j'ai trouvé des taux de transduction comparables dans les oreilles droite et gauche, un taux de transduction plus élevé à la base qu'à l'apex de la cochlée, et globalement, un taux de transduction plus élevé ~5 jours après injection. Quant à l'AAV-DJ, la transduction n'était efficace que lorsque l'injection était réalisée après E15.5. Ces résultats suggèrent que l'efficacité de transduction de ces vecteurs viraux augmente parallèlement à la maturation des cellules de la base vers l'apex, et qu’au moins 3 jours sont nécessaires pour une forte expression de la GFP. Mon travail a révélé l'expression des principaux composants de la voie Shh dans l'épithélium neurosensoriel en développement de E12.5 à E15.5. Il a également établi les fenêtres temporelles permettant une transduction efficace des cellules cochléaires par les sérotypes AAV-PHP.eB et AAV-DJ. Cette approche virale semble adaptée à la manipulation de l'expression des gènes à partir des stades embryonnaires tardifs. Pour les stades embryonnaires plus précoces, d'autres approches conditionnelles devraient être envisagées, y compris d'autres vecteurs viraux ou la génétique (système CreERT2 -lox).

The cochlea is the auditory sensory organ of mammals. It is a long spiral-shaped organ that decomposes complex sounds into distinct frequency components analyzed at different positions along its longitudinal axis (length). This frequency-position organization of the cochlea is supported by its morphological and mechanical properties that gradually vary along its longitudinal axis, also called basal-to-apical axis. Past studies showed that the Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway controls the establishment of the basal-to-apical axis of the cochlea, its size, and the differentiation of its auditory sensory cells. Yet, the time windows during which Shh controls these distinct processes during embryonic development are not well defined. It’s also not clear how morphological gradations arise along the basal-to-apical axis of the cochlea, and how Shh signaling contributes to these processes. My thesis project falls within the scope of these questions, and my objectives were (i) to characterize the activity of the Shh pathway within the developing cochlear neurosensory epithelium and (ii) to develop tools to manipulate gene expression temporally and spatially in the developing cochlea, at embryonic stages, with a primary focus on Shh signaling. To characterize Shh signaling activity, I first imaged whole mount cochlea expressing the Gli-reporter gene Tg(GBS-GFP) at embryonic days E13.5 and E14.5, but I couldn’t detect any specific GFP signal within the epithelium, suggesting that Shh signaling might be too low to be detected by this approach. Yet some GFP positive cells were present in the underlying mesenchyme. I next performed RNAscope in sections of whole head embryos (from E12.5 to E15.5), using probes targeting Shh pathway components (Gli transcription factors, Patched1 receptor, and Sonic Hedgehog). Overall, these genes are expressed in the sensory epithelium and surrounding tissues. Remarkably, Patched1 shows a graded expression, with highest expression at the cochlear apex at later stages (E15.5), nearest to the known spiral ganglion source of Shh, suggesting a modulation of Shh signaling by the epithelium. In parallel, I characterized two adeno-associated viral (AAV) vectors as tools for manipulating gene expression in the developing sensory epithelia of the inner ear. The AAV-PHP.eB and AAV-DJ serotypes were known to transduce sensory cells and supporting cells, respectively, with a high efficiency at postnatal stages, but their transduction rate was not characterized at embryonic stages. My first challenge was to develop the surgical procedure and practice to routinely perform in utero injections into the inner ear, from E13.5. By quantifying the transduction rate of AAV-PHP.eB at 48h, 72h and ~5 days post-injection, I found comparable transduction rates in the right and left inner ears, a higher transduction rate at the base than at the apex of the cochlea, and overall, a higher transduction rate at ~5 days post-injection. Injecting AAV-PHP.eB later at E14.5 also increased the transduction rate. As for AAV-DJ, the transduction was efficient only when the injection was performed after E15.5. These results suggest that the transduction efficiency of these viral vectors increases parallel to the maturation of cells from the base to the apex. In addition, more than 3 days are necessary to obtain a high expression of the reporter gene. My work revealed the expression pattern of the major Shh-pathway components within the developing neurosensory epithelium from E12.5 to E15.5. My work also established the temporal windows suitable for an efficient transduction of cochlear cell by the AAV-PHP.eB and AAV-DJ serotypes. This viral approach appears suited for manipulating gene expression from late embryonic stages on. For earlier embryonic stages, other conditional approaches should be considered including other viral vectors or genetics (CreERT2 -lox system).