Modélisation, visualisation et quantification de la dynamique d'extrusion de boucle de chromatine en cellules humaines vivantes

Modeling, visualizing and quantifying chromatin loop extrusion dynamics in living human cells

• Auteur / Autrice : Thomas Sabaté
• Direction : Christophe Zimmer, Édouard Bertrand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 12/09/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie computationnelle et quantitative (Paris ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Gaëlle Legube
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Coulon, Mario Nicodemi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Wendy Bickmore, Evi Soutoglou

Mots clés

Mots clés contrôlés

Simulation par ordinateur

Polymères

Cohésine

Chromatine

Extrusion (biologie cellulaire)

Imagerie tridimensionnelle en biologie

Mots clés libres

Organisation 3D du génome

Extrusion de boucle de chromatine

Imagerie en cellule vivante

Simulations de polymères

Cohésine

3D genome organization

Chromatin loop extrusion

Live-Cell imaging

Polymer simulations

Cohesin

Résumé

L’étude de l’organisation 3D du génome a révélé l’existence de boucles de chromatine et des Topologically Associating Domains (TADs) de l’ordre de plusieurs centaines de kilobases, créés par l’anneau de cohésine par le processus d’extrusion de boucle d’ADN. Cependant, ces structures ont été caractérisées presque exclusivement par des techniques de génomique et d’imagerie de cellules fixées, leur dynamique temporelle reste donc peu comprise. Par exemple, la durée des contacts créés par extrusion de boucles n’est pas définie et des paramètres majeurs de ce processus comme la durée de vie des contacts ancre-ancre et la vitesse d’extrusion in vivo sont toujours inconnus. Pour répondre à cette lacune, j’ai quantifié la dynamique de l’extrusion de boucle cohésine-dépendante en visualisant et suivant dans le temps plusieurs paires d’ancres de boucles dans des cellules humaines vivantes. Il est attendu que l’extrusion de boucle soit identifiée par une diminution progressive de la distance ancre-ancre. Cependant, cette signature est occultée par la dynamique stochastique de la chromatine, les ancres de boucles pouvant entrer en contact même sans extrusion. De plus, mesurer la distance ancre-ancre à partir d’images fluorescentes est rendu difficile par plusieurs sources d’erreurs comme les erreurs aléatoires liées à la localisation de points fluorescents. Pour estimer les conditions expérimentales qui permettent de détecter et quantifier l’extrusion de boucles malgré ces complications, j’ai utilisé des simulations de polymères et modélisé le processus d’extrusion de boucle in silico. De plus, j’ai testé et validé de nouvelles méthodes d’analyse pour quantifier les boucles de chromatine à partir d’images statiques (e. g. à partir d’images d’ancres de boucles acquises par DNA FISH), estimer la fraction, fréquence et durée de vie des contacts ancre-ancre, ainsi qu’estimer la vitesse d’extrusion effective in vivo à partir d’images dynamiques. En se basant sur les résultats des simulations de polymères, j’ai taggué par fluorescence de multiples ancres de boucles et TADs dans des cellules vivantes par le système CRISPR/Cas9. Nous avons conclu que les contacts entre les ancres étaient peu fréquents et de courte durée, par rapport à la durée du cycle cellulaire. Cependant, les boucles sont presque constamment soumises à l’extrusion par la cohésine. En comparant les résultats de modélisation et les expériences, nous avons pu estimer des paramètres biophysiques généraux de la dynamique d’extrusion de boucles. Ces résultats suggèrent que l’extrusion de boucles de chromatine cohésine-dépendante est un processus hautement dynamique, qui crée des interactions à longue portée transitoires plutôt que des contacts stables. Mes résultats aideront à comprendre quantitativement des processus biologiques fondamentaux qui utilisent les contacts transitoires mais à longue distance créés par l’extrusion de boucles, comme la réparation de l’ADN et la régulation de l’expression des gènes.

Studies of spatial genome organization have revealed the existence of chromatin loops and Topologically Associating Domains (TADs) of several hundred kilobases in size, which are created by the cohesin ring complex through a process of DNA loop extrusion. However, these structures have been characterized almost exclusively by genomic techniques and fixed cell imaging, thus their temporal dynamics are still poorly understood. For example, it is not clear whether loop extrusion creates stable or transient contacts at loop anchors and key parameters of this process, including loop lifetime and extrusion speed, remain unknown. To address this gap, my thesis aims to quantify the dynamics of cohesin-dependent loop extrusion by visualizing and tracking in time pairs of anchors at several loops and TADs in living human cells. Extrusion is expected to manifest itself as a progressive decrease in anchor-anchor distances. However, this signature is obscured by stochastic motions of the chromatin, whereby anchors can occasionally come into contact even without extrusion. Furthermore, measuring the anchor-anchor distance from fluorescent images is complicated by several sources of uncertainties, such as unavoidable random errors in the computational localization of fluorescent spots. To evaluate the experimental conditions under which one can expect to detect and quantify loop extrusion despite such complications, I first performed an analysis in silico using polymer simulations that account for loop extrusion. Using these simulations, I also tested and validated novel analysis methods to quantify chromatin loop dynamics from static imaging (e. g. from DNA-FISH images of loop anchors), and to estimate the lifetime and frequency of anchor contacts, as well as the effective loop extrusion speed from dynamic imaging in vivo. Using the simulation results as guidelines, we fluorescently labelled multiple loop and TAD anchors in human cells using the CRISPR/Cas9 system and tracked the loop anchors by live-cell imaging. Based on our analysis of the imaging data, we found that contacts between the two loop anchors are infrequent and short-lived as compared to the cell cycle duration. However, loops were found to be almost constantly extruded by cohesin. By comparing simulations and experimental data, we could estimate key biophysical parameters of loop extrusion dynamics including loop lifetimes and extrusion speed. Our results suggest that cohesin-dependent loop extrusion is a highly dynamic process, which creates transient long-range interactions rather than stable contact s. Our findings will help to quantitatively understand biological processes that involve short-lived but long-range contacts created by loop extrusion, including mechanisms of DNA repair and gene regulation.