Étude de l'invasion des epitheliums par C. albicans en miscroscopie à haut débit

Investigating Candida albicans epithelial infection using a high-throughput microscopy-based assay

• Auteur / Autrice : Alice Pascault
• Direction : Allon Weiner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie et immunologie
• Date : Soutenance le 27/09/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre d'immunologie et des maladies infectieuses (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Hennequin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alice Lebreton, Karine Dementhon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frédéric Dalle, Vishukumar Aimanianda

Mots clés

Mots clés contrôlés

Relations hôte-champignon

Microscopie de fluorescence

Candida albicans

Cellules épithéliales

Mots clés libres

Pathogènes fongiques

Interface hôte-Pathogène

Microscopie à fluorescence

Analyse d'images

Fungal pathogens

Host-Pathogen interface

Fluorescent microscopy

Image analysis

Résumé

Les infections fongiques représentent un problème émergeant de santé publique dans les pays développés. C. albicans est une levure dimorphique, commensale des muqueuses orales, génitales et intestinales d’une majorité de la population saine. Elle peut cependant conduire à des infections locales, comme les candidoses orales et vaginales voire à des infections systémiques chez les patients immunodéprimés. Si les interactions entre C. albicans et le système immunitaire de l’hôte sont désormais de mieux en mieux connues, l’invasion des épithélia qui est pourtant à l’origine des processus d’infection, demeure mal comprise. Quatre étapes ont été décrites : l’adhésion de la levure aux cellules de l’hôte, suivi par la filamentation qui permet d’obtenir une hyphe capable d’invasion et parfois de dommage infligé aux les cellules hôtes pouvant aboutir à une translocation dans les tissus profonds. Plusieurs facteurs ont été décrits, tant du côté de l’hôte que du pathogène, comme jouant un rôle dans l’invasion des epithelia, incluant les adhésines et invasines fongiques, la toxine candidalysine et l’E-cadherin de la cellule hôte. Une étude récente de notre équipe basée sur une technique de microscopie live à l’échelle cellulaire a permis de déterminer que l’invasion précoce des cellules épithéliales HeLa et Caco-2 peut faire intervenir deux modes d’interaction et donc deux modes de vie fongiques distincts : (1) l’invasion conduisant au dommage cellulaire, au cours de laquelle la membrane plasmique de la cellule hôte est rompue, fréquemment suivie de la mort de la cellule hôte (2) l’invasion au travers de tunnels trans-cellulaires (CaTCT) au cours de laquelle les hyphes envahissent les cellules hôtes entourés de tunnels de membrane cellulaire, sans dommage. Ces tunnels peuvent être multicellulaires et sont constitués de couches membranaires successives. Les mécanismes moléculaires conduisant à la formation de ces tunnels tant du point de vue fongique que du point de vue de l’hôte ne sont pas connus. L’objectif de ma thèse était d’identifier et de caractériser les facteurs d’hôte et du pathogène impliqués dans l’infection des cellules épithéliales Caco-2, qui ne fait intervenir que l’invasion au travers de CaTCT jusqu’à 9 heures d’infection. A cette fin j’ai développé un outil expérimental de microscopie permettant de quantifier de façon objective, universelle (i.e. pouvant s’appliquer à de nombreux modèles fongiques et de cellules hôtes) et à haut débit l’adhésion, la filamentation l’invasion et le dommage cellulaire au cours d’une seule expérience d’infection in vitro. Cet outil a ensuite été utilisé afin d’étudier plusieurs aspects dede la formation des CaTCT : (1) le rôle de la protéine fongique Als3 au cours de l’adhésion et de l’invasion (2) l’origine cellulaire des membranes impliquées dans les CaTCT (3) le rôle de la toxine peptidique candidalysine et des aspartyl-protéases (4) le métabolisme fongique au cours de l’invasion et notamment du métabolisme du glycogène (5) l’immunité de l’hôte au niveau des muqueuses au travers de la secrétion d’IgA. Le protocole mis en place m’a également permis de screener des souches cliniques commensales et issues d’infections systémiques afin de rechercher de nouveaux facteurs de virulence fongiques. Pour conclure, la nouvelle méthode expérimentale développée au cours de ce projet a permis quelques avancées dans la compréhension du processus énigmatique des CaTCT, et pourra servir à de futures études de l’infection de epithelia par C. albicans mais aussi à celles d’autres pathogènes.

Fungal infections are an emerging threat to human health in developed countries. Candida albicans is a dimorphic yeast which colonizes the oral, genital and intestinal mucosa as part of the commensal flora of most of the healthy population. However, it can also lead to local infections such as oral and vaginal thrush and in susceptible patients to severe systemic infections. While much effort has been made in deciphering the interplay between C. albicans and the host at the immunological level, infection begins with invasion of the host epithelium, a process that is only partially understood. At the onset of infection, C. albicans transforms from a yeast to a filamentous hyphal form that can invade and damage epithelial cells, sometimes followed by translocation deeper into host tissues. Several fungal and host molecular factors have been shown to regulate epithelial invasion, including fungal adhesins, invasins and secreted factors such as the fungal toxin candidalysin, as well as host factors such as E-cadherin, which plays a role in C. albicans endocytic uptake. Recent work from our lab based on single cell, live imaging of early invasion into HeLa and Caco-2 cell lines revealed that two invasive lifestyles involving distinct host cellular niches can be exploited by the fungus: (1) Damaging invasion, in which host membranes are breached, leading most often to host cell death; (2) C. albicans trans-cellular tunnelling (CaTCT), in which hyphae extend within host membrane-derived transcellular tunnels without host damage. During CaTCT, hyphae can traverse through several host cells in sequence, leading to the formation of multi-layered tunnel structures. Currently, the molecular factors and cellular mechanisms regulating CaTCT from both the fungal and host sides remain almost entirely undescribed. The objective of my thesis project was to identify and characterize molecular factors and cellular processes regulating early Caco-2 infection by C. albicans, which occurs exclusively via CaTCT for up to 9 hours post-infection. For this purpose, I developed a novel quantitative, high-throughput and universal (i.e. applicable to a wide variety of fungal and host models) experimental imaging assay that uses an automated non-biased approach to provide single cell readouts pertaining to adhesion, hyphal formation, invasion and host damage in a single experiment. I then applied this assay to study several distinct aspects of CaTCT: (1) the function of the fungal Als3 protein in C. albicans adhesion and invasion; (2) the reservoir of host membranes implicated in trans-cellular tunnel formation and extension; (3) the function of the fungal toxin candidalysin and fungal secreted aspartyl proteases (Saps); (4) nutrient uptake and glycogen metabolism ; (5) the role of host secreted IgA in immune defence at the epithelial surface. In order to identify new potential virulence factors, I also employed the assay to screen for differences in epithelial infection between C. albicans clinical strains isolated from commensal and invasive origins. Overall, my work has provided several new insights into the mechanism of CaTCT, which act to further enhance our knowledge of this enigmatic process. Furthermore, the experimental assay developed in this project has important potential applications for future targeted studies and screens relating to C. albicans epithelial infection, as well as infection by other fungal pathogens.