Optimisation de rapporteurs fluorescents d'interactions protéine-protéine par ingénierie des protéines à l'aide de protéines orthologues

Fluorescent reporters of protein-protein interactions optimized by orthology-based protein engineering

• Auteur / Autrice : Louise-Marie Rakotoarison
• Direction : Arnaud Gautier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie physique
• Date : Soutenance le 30/06/2023
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Édouard Bertrand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Gagey
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marie Erard, Matthieu Sainlos

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biotechnologie

Protéines fluorescentes

Interactions protéine-protéine

Mots clés libres

Chimiogénétique

Fluorescent

Interactions protéines protéines

Rapporteurs fragmentés

Orthologie

Chemogenetic

Fluorescent

Protein protein interaction

Split reporters

Orthology

Résumé

Les interactions protéine-protéine peuvent être détectées par la complémentation spécifique de rapporteurs fluorescents composés de deux fragments complémentaires qui se réassemblent en un rapporteur fluorescent fonctionnel lorsqu'ils sont à proximité. Notre laboratoire a développé précédemment splitFAST, un rapporteur chimiogénétique prometteur à complémentation rapide et réversible, permettant le suivi d'interactions protéine-protéine dynamiques. Dans ce travail de thèse, nous présentons l'ingénierie de RspA-splitFAST, un rapporteur d’interaction protéine-protéine amélioré présentant une brillance plus élevée, une auto-complémentation plus faible et une gamme dynamique plus élevée pour une détection optimale de ces intéractions. Nous avons utilisé une stratégie originale d'ingénierie des protéines qui exploite la diversité des séquences trouvées dans les protéines avec une relation d'orthologie pour générer des rapporteurs fragmentés avec diverses propriétés dynamiques tout en conservant leur fonctionnement global. Notre étude a permis d'identifier un système aux propriétés améliorées et de mieux comprendre les caractéristiques moléculaires contrôlant les propriétés de complémentation. En raison de la rapidité et de la réversibilité de sa complémentation, de sa faible auto-complémentation, de sa gamme dynamique élevée et de sa brillance améliorée, RspA-splitFAST présente des propriétés idéales pour étudier les interactions protéine-protéine avec une résolution spatiale et temporelle élevée, ce qui ouvre de grandes perspectives pour comprendre le rôle des interactions protéine-protéine dans divers contextes biologiques.

Protein-protein interactions (PPI) can be detected through selective complementation of split fluorescent reporters made of two complementary fragments that reassemble into a functional fluorescent reporter when in close proximity. Our lab previously reported splitFAST, a promising chemogenetic split reporter with rapid and reversible complementation, allowing the monitoring of dynamic protein-protein interactions. In this doctoral thesis, we present the engineering of RspA-splitFAST, an improved PPI reporter displaying higher brightness, lower self-complementation and higher dynamic range for optimal monitoring of PPI. We used an original protein engineering strategy that exploits the sequence diversity found in proteins with orthology relationship to generate split reporters with various dynamic properties while keeping the overall function. Our study allowed the identification of a system with improved properties and enabled to better understand the molecular features controlling the complementation properties. Because of the rapidity and reversibility of its complementation, and its low self-complementation, high dynamic range and improved brightness, RspA-splitFAST exhibits ideal properties to study protein-protein interactions with high spatial and temporal resolution, opening great prospects to decipher the role of protein-protein interactions in various biological contexts.